去甲汉黄芩素抗脓毒症潜在靶点的筛选与鉴定

柏慧，王新会，娄佳悦，李小清，陈桂荣

(辽宁中医药大学药学院，辽宁 大连 116600)

脓毒症是重度烧伤、创伤、感染、休克和大手术等后常见的并发症，由于宿主无法对感染的反应进行调控，继而引发的全身炎症反应症候群，是临床危重患者的主要死亡原因之一[1-3]。由流行病学研究可知，世界上每年有两千万左右的脓毒症患者，其中进展为重症脓毒症(severe sepsis)或脓毒症休克(septic shock) 大约30%～40%，致死率高达25%～70%[4]。目前，关于脓毒症的发病机制的认识正在不断深入，但是对脓毒症有效的治疗方法的研究却未能取得较好的成效。并且，当前并无确切有效的临床用药。因此，对于预防和治疗脓毒症的有效药物和治疗方法的研究，是具有临床意义和未来应用价值的。

以往的研究表明黄连解毒汤对脓毒症具有良好的治疗作用，黄连解毒汤中含有的成分之一去甲汉黄芩素(见图1)是一种黄酮类化合物，黄连解毒汤在我国临床上有广泛的应用，有活血化瘀，止痛等多种药理作用。经研究，去甲汉黄芩不仅可以减少心肌缺血/再灌注损伤的梗死面积、改善心功能，还有其他重要作用，比如去除ROS并可降低白细胞介素-1β(IL-1β)、IL-6、和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的表达。而这些炎症指标以及心功能等调整跟脓毒症都密切相关[5-8]。然而，去甲汉黄芩素抗脓毒症的作用机制和靶点仍不清楚。以网络大数据为靶点的预测是通过计算方法将化合物及其作用的目标靶点和疾病靶点的信息结合起来，通过识别活性小分子的作用蛋白，来探索小分子对于疾病的作用靶点以及机制，这是加快新药开发的一种方法[9]。因此，在本文中，利用网络大数据，对靶点进行预测及验证，进而分析和筛选去甲汉黄芩素抗脓毒症的潜在靶点。

图1 去甲汉黄芩素化学结构

1 材料

去甲汉黄芩素sdf格式文件，Swiss TargetPrediction服务器(http://www.swisstargetprediction.ch)，TCMSP数据库(DRAR-CPI服务器(http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php)，分子对接服务器(http://systemsdock.unit.oist.jp)。

2 方法

2.1 药理参数、分子特性评价与靶标预测 熟悉并掌握化合物的药理参数和化合物的分子特性对加深该化合物的成药性能的理解以及明确合适的药物剂型具有重要的意义，随之而来减轻了药物研发前期大量的筛选工作负担。利用中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)数据库，评价去甲汉黄芩素体内过程的药代动力学(ADME)[10]。

2.2 DRAR-CPI靶标预测 新药开发的第一步是靶点预测，如何明确的筛选化合物的靶向蛋白药是物开发的核心问题。DRAR-CPI服务器(https://cpi.bio-x.cn/drar)通过化学蛋白质相互作用分析来预测化学成分的靶向蛋白。先将参数设为默认值，然后将去甲汉黄芩素 (PubChem CID：5281674)的sdf文件上传到DRAR-CPI服务器，最后筛选Z′-score<-0.5的靶向蛋白。

2.3 Swiss TargetPrediction靶标预测 使用Swiss TargetPrediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)服务器，并在Marvin for JavaScript Version 6.1上参照PubChem数据库上传去甲汉黄芩素 (PubChem CID：5281674)的结构，继而进行靶点筛选。

2.4 推测去甲汉黄芩素抗脓毒症的靶标 以DRAR-CPI及Swiss TargetPrediction服务器预测到共有的去甲汉黄芩素 靶向蛋白作为潜在靶标信息同?倢?类孟德尔遗传病数据库(http://www.omim.org/)、毒性与基因?倱?较数据库(https://ctdbase.org/)和药物靶点数据库(http://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/)中有关脓毒症部分的靶标与之相配，由此可以筛选出，既是脓毒症的靶标蛋白又是去甲汉黄芩素的靶标蛋白，再将所得结果进行分析归纳。

2.5 分子对接 先向(https://www.dockingserver.com/web/docking)分子对接服务器中输入“2.1”和“2.2”项下提及的有关蛋白PDB的 ID，再向服务器上传甲汉黄芩素 的sdf文件，进行连接，并对结果进行分析。

3 结果与讨论

3.1 药理参数和分子特性评价 了解并掌握化合物的药理参数和化合物的分子特性，就能够加深对该化合物的成药性能的理解，明确合适的药物剂型，进而减少药物研发前期大量的筛选操作[11]。其中口服去甲汉黄芩素的体内生物利用度(OB)是39.40%，比限量30%大，药物相似度(DL)为0.21，比0.18大，可旋转键数(RBN)为1，表明去甲汉黄芩素的口服吸收以及成药性良好。药物可以维持长时间的疗效，其半衰期(HL)为16.93，半衰期较长，建议做成普通口服制剂。去甲汉黄芩素 ，分子量(MW)为270.25 Da，比500 Da小，油水分配系数为2.33，比5小，氢键供体为3和氢键受体为5，均接近5，与Lipinski′s[12]的5原则较为统一，说明成药可能性较高。

3.2 靶标预测 靶标预测是新药开发的第一步，如何明确筛选化合物的靶向蛋白已经成为药物开发的核心问题[9]。这一目的通过分子反向预测靶标的计算钓靶方法已经逐渐被推广开来。通过DRAR-CPI共筛选出392个靶标，在Swiss TargetPrediction服务器中进行筛选，获得15个去甲汉黄芩素的相关靶点；结果中 Z′<-0.5的靶标共95个，(Z′<-0.5表明具有良好的靶向性)；再将Swiss TargetPrediction服务器和DRAR-CPI筛选到靶点合并，把重复靶点删除，最后共得到105个靶点。

在人类孟德尔遗传病数据库(OMIM),毒性与基因比较数据库(CTD)和药物靶点数据库(TTD)中输入 “sepsis”，从毒性与基因比较数据库(CTD)筛选到26个靶标蛋白，人类孟德尔遗传病数据库(OMIM)筛选到117个靶标蛋白，药物靶点数据库(TTD)筛选到21个蛋白，其中共有疾病靶标149个，把预测到的105个去甲汉黄芩素的靶标蛋白和疾病靶标匹配，结果发现既是分子靶标又是疾病靶标的蛋白有7个[即：丝氨酸蛋白酶抑制蛋白E1(SERPINE1)、组织蛋白酶G(CTSG) 、蛋白C(PROC) 、凝血因子Ⅸ(F9)、嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)、丝裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)、人雌激素受体β(ESR2) ]，具体筛选流程见图2。

图2 去甲汉黄芩素靶标鉴定流程图

3.3 分子对接 在本实验中可以发现，对去甲汉黄芩素和相关蛋白，基于使用dockingserver分子对接服务器，进行了分子对接。结果见表1，计算结果的自由结合能小于-5 kcal·mol-1的靶标有CTSG、ESR2、F9、PNP和MAPK1，由计算结果可以得出去甲汉黄芩素具有结合这些靶标的能力[13]。

从图3可以看出去甲汉黄芩素与ESR2的疏水相互作用残基包括PHE356、MET336、LEU343、LEU301、ALA302、MET340、LEU476、THR299、ILE376、ILE373、ARG346以及GLU305。去甲汉黄芩素与PNP的疏水相互作用残基包括SER220、ARG84、SER33、TYR88、HIS86、TYR192、PHE200、MET219、VAL217、ASN115以及GLU201。根据以上数据可以得出结论：去甲汉黄芩素可能会通过这些具有关键性的残基与PNP和ESR2发生交互作用，从而才可以发挥药物作用。

表1 去甲汉黄芩素与靶标蛋白相互作用分子对接数据如下表所示

脓毒症及其引发的休克和多器官衰竭是成人重症监护病房死亡的主要原因。虽然脓毒症治疗的外科方法和药理学研究正在不断改进，但流行病学研究表明，在过去20年中，脓毒症的发生率明显增加[14]。因此寻找有效的药物一直是研究的热点，本研究发现去甲汉黄芩素可能通过结合CTSG、ESR2、F9、PNP和MAPK1等蛋白起到抗脓毒症作用。

脓毒症发生时，凝血系统级联反应会被激活，严重者会导致脓毒症患者多器官功能衰竭甚至死亡[15-16]，而凝血因子F9参与凝血的内在途径，跟脓毒症密切相关[17]。研究表明脓毒症大鼠下丘脑中枢的雌激素受体ESR2表达量降低，且炎症介质与雌激素受体表达呈负相关，而大多数脓毒症患者存在雌激素水平的紊乱，推测雌激素能缓解脓毒症所导致的炎症反应保护机体各个器官[18]。脂多糖(LPS)是引起脓毒症的主要原因，能介导全身炎症反应，炎性介质能激活不同MAPK以促进或抑制基因的转录，调控其他炎性介质的生成，MAPKI基因在炎症与细胞凋亡等应激反应中发挥重要作用。p38MAPK通路能够调节炎症进展，密切参与脓毒症[19]，MAPK1是p38MAPK通路关键的信号物质，研究表明在脓毒症大鼠中肺组织以及心肌组织的MAPK1表达均显著升高，表明通过调节MAPK1能起到保护脓毒症造成的肺组织及心肌组织的损伤[20-21]。CTSG作为一种丝氨酸类蛋白酶，可以水解活化前IL-1β以及TNF-α等细胞因子参与炎症部位病原体清除、消化、吞噬和结缔组织的重塑，在炎症性疾病产生和发展过程中都发挥着重要的作用，而全身炎症反应是脓毒症的经典症状同时它还往往伴随着急性肺损伤等[22]。嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)是嘌呤核苷酸磷解的必需酶，该酶的先天性缺陷会通过选择性耗竭T细胞而导致严重的免疫缺陷综合征，而脓毒症的发生发展跟T细胞密切相关[23]。内源性活化PROC可以通过其抗炎作用来抑制脓毒症凝血和抗炎反应，PROC可以通过抑制凝血酶的形成进而减轻炎症反应，从而干扰脂多糖与胞膜上受体CD14的相互作用等。F9是一类具有丝氨酸蛋白酶活性的凝血因子。因此，去甲汉黄芩素可能通过与靶向蛋白PROC和F9结合，进而抑制凝血并减轻脓毒症炎症反应。

A.ESR2与去甲汉黄芩素分子对接图；B.ESR2与去甲汉黄芩素的2D交互配图；C.PNP与去甲汉黄芩素分子对接图；D.PNP与去甲汉黄芩素的2D交互配图图3 去甲汉黄芩素与ESR2和PNP分子相互作用

综上，去甲汉黄芩素能通过调节F9参与凝血系统级联反应，通过调节ESR2维持雌激素水平的稳定，通过调节CTSG、MAPK1和PNP起到保护脓毒症损伤器官的作用，最终通过缓解脓毒症的症状及炎症等水平起到抗脓毒症作用。