特色民族药土牛膝中齐墩果酸的含量测定研究

胡亮，李瑞莲，王湘波，周明

(1.湖南省药品检验研究院<湖南药用辅料检验检测中心>，湖南 长沙 410001；2.湖南省药品质量评价工程技术研究中心，湖南 长沙 410001)

土牛膝作为瑶族常用药，应用十分广泛，植物基原主要包括苋科植物粗毛牛膝(AchyranthesasperaL.)、野生牛膝(AchyranthesbidentataBlume)及柳叶牛膝(AchyrantheslongifoliaMakino)的干燥根及根茎。具有清热解毒、消炎、利咽化痰等作用，用于急慢性咽喉炎、扁桃体炎、类风湿关节炎等[1-4]。土牛膝中含有以齐墩果酸为母核的三萜皂苷类成分，水解产物齐墩果酸具有抗氧化、消炎、抗动脉粥样硬化等生物活性[5-9]。粗毛牛膝、野生牛膝及柳叶牛膝中齐墩果酸含量测定未见相关文献报道，本研究以齐墩果酸作为指标，并对收集的28批次土牛膝样品进行测定研究；同时对常见混伪品广东土牛膝、川牛膝进行比较，结果均未检出齐墩果酸[10-11]，具体研究情况如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Waters 2695液相色谱仪，2998二级管阵列检测器；Mettler AE240型电子天平(梅特勒-托利多，万分之一)；XSE205DU型电子天平(梅特勒-托利多，十万分之一)。

1.2 试药 齐墩果酸对照品(批号：110709-201808，纯度：91.1%)由中国食品药品检定研究院提供；乙腈为色谱纯(Fisher Chemical)；盐酸(国药集团化学试剂有限公司)等其他试剂均为分析纯。28批次土牛膝样品(野生牛膝16批次、粗毛牛膝7批次、柳叶牛膝5批次)收集于湖南、江西、山东等地，另外2批次广东土牛膝收集于广东，2批次川牛膝收集于四川和重庆(见表1)，并由湖南省野生动植物司法鉴定中心进行鉴定。

表1 样品收集情况表

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Symmetry C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm；沃特斯仪器公司)，以乙腈-水(90∶10)为流动相；流速1.0 mL·min-1；检测波长210 nm；柱温35 ℃。理论塔板数按齐墩果酸峰计算应不低于5 000。对照品及样品的色谱图见图1。

A．对照品;B.药材 1.齐墩果酸图1 土牛膝药材高效液相色谱图

2.2 对照品溶液制备 精密称取齐墩果酸对照品10.46 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液①(1.046 mg·mL-1)。

2.3 供试品溶液制备 取样品粉末(过三号筛)约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入盐酸甲醇溶液(1∶9)25 mL，称定重量，加热回流1 h，放冷，称定重量，用盐酸甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 线性关系考察 精密吸取对照品溶液①(1.046 mg·mL-1)1、2、5、10、15、20 μL注入液相色谱仪，测定，以峰面积积分值为纵坐标，进样量(μg)为横坐标，绘制标准曲线。其回归方程为：Y=475 854.75X-48 359.23，R2=1.00。结果表明：齐墩果酸对照品在1.046～20.92 μg范围内线性关系良好。

2.5 精密度试验 精密吸取“2.2”项下对照品溶液①(1.046 mg·ml-1)5 μL，连续进样6次，记录峰面积。结果齐墩果酸峰面积的平均值为2 415 412，RSD为0.58%(n=6)，表明仪器精密度良好。

2.6 重复性试验 取样品粉末(S7)，分别按照“2.3”项下方法制备供试品溶液各6份，记录峰面积，计算含量。结果各份供试品溶液的齐墩果酸的平均值为26.46 mg·g-1，测定结果RSD(n=6)为0.12%，结果表明重复性良好。

2.7 稳定性试验 取“2.6”项下土牛膝同一份供试品溶液，室温下放置，在0、6、12、18、24 h 分别进样10 μL进行分析，分别记录峰面积，计算RSD为0.38%，结果表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.8 加样回收率试验 取已测定含量的样品(S7，齐墩果酸平均含量为26.46 mg·g-1)0.5 g，共6份，分别精密称定，置已精密加入对照品溶液(7.21 mg·mL-1)2 mL蒸干后的具塞锥形瓶中，精密加入盐酸甲醇溶液(1∶9)25 mL，密塞，称定重量，加热回流1 h，放冷，称定重量，用盐酸甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。照上述液相色谱条件下进样分析，按外标法计算加样回收率，6批样品平均回收率为96.29%，RSD为1.66%。结果表明该法加样回收率较好(见表2)。

表2 回收率试验结果表

2.9 检测限和定量限 取“2.2”项下齐墩果酸对照品溶液，用甲醇稀释，以信噪比为3∶1的浓度作为仪器检测限，信噪比为10∶1的浓度为仪器定量限，测定其检测限和定量限分别为0.63 ng和2.13 ng。

2.10 样品测定 对收集的样品分别按照“2.3”项下方法制备供试品溶液，按干燥品计算齐墩果酸含量，测定结果见表3。同时对常见混伪品川牛膝、广东土牛膝进行测定(见图2)，结果均未检出齐墩果酸。

表3 土牛膝样品中齐墩果酸含量测定结果表(n=2)

A.土牛膝;B.川牛膝;C.广东土牛膝 2.齐墩果酸峰图2 土牛膝、川牛膝及广东土牛膝色谱叠加图

3 讨论

供试品溶液制备方法采取盐酸甲醇溶液(1∶9)加热回流提取，同时对不同提取溶剂比例(1∶7、1∶11、1∶15、1∶20)、溶剂体积(10、20、25、50 mL)及提取时间(30、50、60、70 min)进行考察，最终确定供试品制备方法为盐酸甲醇溶液(1∶9)25 mL，加热回流1 h。采用DAD检测器在190～420 nm范围内扫描齐墩果酸色谱峰的紫外吸收，结果在210 nm有最大吸收，故检测波长确定为210 nm。

研究结果表明，不同基原土牛膝中齐墩果酸含量差异较大，其中7批次粗毛牛膝含量范围为1.0683%～2.7562%，平均值为1.954%；16批次野生牛膝含量范围为1.3957%～2.7617%，平均值为2.036%；5批次柳叶牛膝含量范围为0.9694%～1.6921%，平均值为1.372%。整体而言，野生牛膝中齐墩果酸含量高于粗毛牛膝，粗毛牛膝高于柳叶牛膝，常见混伪品川牛膝和广东土牛膝中均未检出齐墩果酸，与土牛膝化学成分差异较大，易于区分。

对不同的采收时间与齐墩果酸含量进行比较，结果表明，冬季采收样品(11月份)含量高于夏季(6月份)采收的样品(见图3)，本研究也佐证了标准中采收时节的合理性；同一时间不同地域采集的土牛膝样品中齐墩果酸含量差异较小，表明土牛膝药材对生长环境条件要求不高。本文研究中以齐墩果酸含量作为考核指标，对3种基原土牛膝(粗毛牛膝、野生牛膝和柳叶牛膝)进行了研究，为最终确定植物基原的收载标准提供了一定的研究基础。

图3 不同基原土牛膝不同采收时间含量分布图