臭氧对不同基质中呕吐毒素的降解效果研究

刘 芳 李萌萌 刘远晓 刘海波 关二旗 卞 科

(河南工业大学粮油食品学院，郑州 450001)

小麦赤霉病(Fusarium head blight，FHB)是由镰刀菌属真菌引起的一种病害，赤霉病侵染小麦后，不仅会降低小麦产量，而且会导致小麦中蛋白质和面筋含量降低、研磨出粉率降低、面制品的颜色加深，进而影响小麦的理化特性及食用品质[1-3]。此外，镰刀菌侵染小麦后在生长和贮藏过程中会产生多种真菌毒素。其中，脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)是由禾谷镰刀菌产生的最主要的一种单端孢霉烯族化合物，是小麦中检出率最高、危害最严重的真菌毒素之一[4]。DON可以与核糖体结合，抑制蛋白质、RNA和DNA的合成，并诱导细胞凋亡，当人和动物摄入DON(超出国家限量标准1 mg/kg) 时，会产生呕吐、腹泻、厌食、恶心、神经紊乱等中毒反应[5]。长期摄入DON，即使是在较低浓度下，也会损害人和动物的健康，摄入过多时可能使造血系统受到损害从而导致死亡[6]。

食品中真菌毒素的防控可分为产前预防和产后削减两个途径。产前预防即在谷物收获前进行，通常使用杀真菌剂和生物防治剂来进行杀菌，或者在谷物中植入外源性基因以增强谷物的抗逆性[7]。真菌毒素的预防过程可能受到多种因素的影响，例如谷物品种、播种时间、培育技术以及储藏方法等，这些因素都会影响谷物中真菌毒素的产生和分布[8]。产后削减方法可分为物理消减、化学降解和生物降解三类，其中物理消减方法主要包括吸附、挤压蒸煮、热处理、辐照等；化学降解一般是使用化学制剂脱毒，如碳酸钠、石灰水、氯气、氨气以及臭氧等气体或水溶液；生物降解可通过微生物代谢、发酵、添加酶制剂等方法来实现对真菌毒素的降解[9]。

臭氧(Ozone，O3)是一种具有极强氧化性和高效杀菌性的气体，将其作为一种化学方法来降解DON已成为一种新兴的、高效的DON降解技术[10]。臭氧能破坏真菌毒素结构中的双键，对产毒真菌具有一定的灭活作用，从而达到降解真菌毒素的目的。此外，臭氧在使用后可自行分解为氧气，无污染残留[11，12]。研究表明，臭氧对谷物、水果和蔬菜中的真菌毒素均具有良好的降解效果，并且能够改善食品的品质[13，14]。本实验研究了臭氧对固态DON、DON水溶液、小麦籽粒以及全麦粉中DON的降解效果及降解规律，并通过对比臭氧对以上不同基质中DON的降解效果，研究基质对DON的臭氧降解效果及规律的影响，从而为臭氧在降解小麦中DON的应用提供更广泛和更深入的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

赤霉病小麦：取3种染病程度不同的赤霉病小麦，初始DON含量分别为1.27、2.82、5.66 mg/kg，初始含水量分别为13.14%、11.61%、11.20%，编号依次为：L、M、H；郑麦103；DON标品(纯度≥99%)；乙腈(色谱级)；乙腈(分析级)；水(电阻率≥18.2 MΩ，TOC≤4 μg/L)。

1.2 仪器与设备

COM-AD-01臭氧发生装置，JSA9紫外臭氧检测器，FW-80高速万能粉碎机，MLU-202布勒磨粉机，HJ-6A恒温磁力搅拌器，12165001B多功能净化柱，MTN-2800D氮吹浓缩仪，5810R高速离心机，Freezone 6plus真空冷冻干燥机，e2695高效液相色谱仪。

1.3 实验方法

1.3.1 臭氧处理

开启臭氧发生器和紫外臭氧检测器，预热30 min以上，直至检测器读数稳定，然后调零。设定臭氧浓度，称取待测样品，将其置于样品反应瓶中进行处理。处理过程中，每隔20 min晃动样品反应瓶，以保证臭氧与样品充分均匀反应。

1.3.2 臭氧处理DON纯品

用色谱级乙腈将1.0 mgDON标准品完全溶解，并定容至10 mL，得到100 μg/mL的DON标准储备液。取适量标准储备液，稀释至10 μg/mL，取0.3 mL该溶液，用高纯氮气吹干，得到3 μg的溶质，将该溶质直接进行臭氧处理，研究臭氧对固态DON的降解效果；此外，取0.3 mL溶液，用高纯氮气吹干后，将其溶质溶于1 mL的水溶液，得到3 μg/mL的DON水溶液，然后进行臭氧处理，研究臭氧对水溶液中DON的降解效果；臭氧处理浓度分别设置为0、2、4、6、8、10 mg/L，臭氧处理时间分别设置为0、10、30、60、120、240 s。

1.3.3 臭氧处理赤霉病小麦

取赤霉病小麦籽粒，参照GB/T 5009.3—2016《食品安全国家标准 食品中水分的测定》测定小麦含水量。将部分小麦籽粒除杂后用万能粉碎机粉碎，粉碎后物料过40目筛，得到全麦粉，分别将这3种小麦籽粒和全麦粉按照1.3.1中步骤进行臭氧处理；另取部分M小麦籽粒，参照NY/T 1094.1—2006《小麦实验制粉 第1部分：设备、样品制备和润麦》调节小麦含水量至15%，并参照NY/T 1094.2—2006《小麦实验制粉 第2部分：布勒氏法 用于硬麦》，采用布勒磨粉机进行研磨制粉，通过以上步骤分别得到调质后的小麦籽粒、调质后的全麦粉、小麦粉以及麸皮，然后通入臭氧进行处理，以上臭氧处理浓度分别设置为0、20、40、60、80 mg/L，处理时间均为60 min。

1.3.4 料液比对DON的臭氧降解效果的影响

取H小麦籽粒及其全麦粉，分别按照料液比为1∶1、1∶2、1∶4、1∶6加入水，然后通入臭氧气体进行处理，臭氧处理质量浓度分别设置为0、20、40、60、80 mg/L，处理时间均为60 min。将经臭氧处理后的小麦籽粒和全麦粉置于高速离心机中以4 000 r/min离心10 min，然后倒掉上清液，在-20 ℃冰箱中预冻24 h后，冷冻干燥48 h，取出后用粉碎机打粉，测定其中DON的含量。

1.3.5 小麦组分对臭氧降解DON效果的影响

取未染病小麦(郑麦103)磨粉，得到麸皮和面粉；将面粉通过水洗法得到小麦淀粉和面筋蛋白。分别称取等量的蛋白质、淀粉和麸皮样品(未加入组分的样品作为对照组)，加入一定浓度的DON溶液，待各试管中样品混匀后，将其放于4 ℃冰箱低温避光保存过夜，以保证各组分与DON反应充分；将以上混合液置于臭氧反应装置中处理，每个样品的反应时间为60 s，臭氧质量浓度分别设定为0、2、4、6、8 mg/L，处理完成后，置于4 ℃冰箱中过夜，以保证臭氧和各组分充分反应；待该混合液反应完全，测定其样品液中DON总溶质含量。

1.3.6 DON的测定

DON的提取、净化、检测及DON标准溶液的配制参照李萌萌[15]、刘远晓等[16]的研究并稍作改动，具体操作步骤如下；

DON的提取：准确称取25 g样品置于250 mL烧杯中，加入100 mL提取液(乙腈/水=84∶16)，然后置于磁力搅拌器上搅拌20 min，静置5 min。

DON的净化：吸取5 mL静置后的上清液过DON多功能净化柱，准确收取滤液4 mL于具塞试管中，低温下氮吹吹干，用流动相(乙腈/水=16∶84)复溶后置于高速离心机中以12 000 r/min离心5 min，然后过0.22 μm有机滤膜，4 ℃保存备用。

DON的检测：使用高效液相色谱对DON进行检测。色谱条件：色谱柱，C18反相色谱柱，4.6 mm×250 mm，填料粒径5 μm；流动相，乙腈/水=16∶84；流速，0.6 mL/min；进样量，10 μL；检测方法，紫外检测，波长218 nm。

DON标准溶液的配制：取1 mLDON储备液低温下氮吹吹干，使用流动相配制成质量浓度为0.1、0.2、0.5、1、2、5、10 mg/L的标准工作液，经0.22 μm有机滤膜过滤，4 ℃保存备用。

DON降解率的计算：DON降解率=(1-CA/C0)×100%

式中：CA为样品经不同方式处理后DON质量浓度/mg/kg；C0为样品中DON的初始质量浓度/mg/kg。

1.3.7 数据分析

所有实验均进行至少3次平行实验，采用Excel 2010进行数据的统计与前期处理，采用SPSS 20进行方差分析，多重比较采用Duncan式。

2 结果与分析

2.1 臭氧对DON纯品降解效果的影响

2.1.1 臭氧处理浓度对DON水溶液和固态状DON的降解效果

洪泽县境内的县乡河道已进行了多轮治理，但以往河道整治主要是清淤。由于上游泥土的带入、水体对河床的淘刷，局部河堤、河坡垦种、倾倒垃圾现象的存在，加速了河道的淤积速度，先期疏浚河道又有回淤现象，因此，仍不同程度存在引排不畅、水体交换缓慢、灌排效益下降等问题。

由图1可知，臭氧不仅可以显著降解DON水溶液，还可以降解固态状DON，且在相同的处理时间条件下，其降解率均随着臭氧处理浓度的增加而显著升高。在臭氧质量浓度为2 mg/L时，二者的DON降解率可达45%左右，在臭氧质量浓度为10 mg/L时，DON降解率可达90%左右。与降解固态DON相比，水溶液中DON的降解率相对较高，当臭氧质量浓度同为6 mg/L、处理时间为60 s时，臭氧对水溶液中DON的降解率可达83%，而对固态DON的降解率为60%左右，这可能是由于水的存在而导致的。有研究表明，臭氧氧化过程中，水的存在会影响DON的降解，它与DON的降解率呈正相关[17]。臭氧分子可溶解进入水中后形成·OH等自由基，再通过自由基降解DON，·OH自由基氧化能力比臭氧分子更强，进而提高了臭氧对DON的降解效果[18]。

2.1.2 臭氧处理时间对DON水溶液和固态状DON的降解效果

由图1可知，在臭氧处理浓度不变时，DON水溶液和固态状DON的降解率均随着臭氧处理时间的增加显著升高。当臭氧质量浓度为6 mg/L、处理时间为10 s时，水溶液中DON的降解率即可达到69.15%，固态状DON能达到60%左右；这表明，臭氧在短时间内即可对不同状态下的DON纯品产生良好的降解效果。有研究表明，使用质量浓度为8 mg/L的气态臭氧处理质量浓度为2 μg/mL的DON水溶液，在15 s内DON降解率即可达到95.68%[19]。DON对臭氧较敏感，较低浓度的臭氧即可对DON产生较好的降解效果。

由图1可知，当臭氧浓度增大到一定程度、处理时间增长至一定值时，DON降解率的增速均呈现变缓的趋势，这可能是因为在臭氧浓度和处理时间达到特定值时，臭氧对DON的降解达到了饱和。臭氧不仅可以在短时间内降解水溶液中的DON纯品，而且可以显著降解固态DON纯品，在采用臭氧降解DON的过程中，臭氧浓度和处理时间是影响DON的臭氧降解效果的两大因素，适当的提高臭氧浓度或增长处理时间，均可显著提高臭氧对DON的降解率[20，21]。

注： DON水溶液初始含量为(2.95±0.03) mg/kg，固态状DON初始含量为(2.93±0.03) mg/kg，采用不同臭氧质量浓度处理时，处理时间均为60 s，采用不同臭氧时间处理时，处理质量浓度均为6 mg/L。图1 臭氧处理浓度和处理时间对DON水溶液和固态状DON的降解效果

2.2 臭氧对赤霉病小麦降解效果的影响

由图2、图3可知，臭氧处理可显著降低小麦籽粒和全麦粉中DON的含量，降解率随着臭氧浓度的增加而升高，且全麦粉中DON的降解率高于小麦籽粒。有研究表明，在臭氧质量浓度为60 mg/L的条件下处理120 min后，小麦籽粒中DON的降解率为17.1%，而全麦粉中为26.4%，这是由于全麦粉与臭氧的接触面积更大，DON能够更彻底地和臭氧发生反应[22]。

可以看出，臭氧对不同含水量的样品中的DON的降解效果不同，M样品在含水量为11.61%、臭氧质量浓度为80 mg/L时，DON的降解率为18.44%，在润麦后，当含水量达到14.3%时，降解率可达27.62%。由此可见，小麦的含水量对小麦中DON的臭氧降解效果有一定影响，含水量高的样品中DON降解率较高[23]。有研究表明，初始含水量为16%的小麦籽粒经过臭氧处理后，DON的降解率比相同条件下臭氧处理初始含水量为11.3%的小麦籽粒高17%左右[22]，含水量为20.10%的小麦粉中DON的降解率显著高于含水量分别为16.29%和11.79%的小麦粉[20]，这与本研究的结果趋势一致。

注：处理时间均为60 min，L小麦籽粒、全麦粉，M小麦籽粒、全麦粉，H小麦籽粒、全麦粉初始DON含量为(1.27±0.05)、(2.82±0.07)、(5.66±0.06) mg/kg。 图2 臭氧对染病程度不同的小麦中DON的降解效果

注：处理时间均为60 min,调质后的小麦籽粒、全麦粉，小麦粉，麸皮中初始DON含量为(2.39±0.04)、(2.13±0.05)、(4.85±0.06) mg/kg。图3 臭氧对小麦不同基质中DON的降解效果

2.3 料液比对小麦籽粒和全麦粉中DON的臭氧降解效果的影响

从图4可以看出，水分对小麦籽粒和全麦粉中的DON有一定去除效果，含水量越高，DON去除效果越好，在料液比为1∶1时，由于全麦粉加水量少，造成结块严重，故基本不发生DON含量的降低。在加水量不断增加时，小麦籽粒和全麦粉中DON的去除量随着加水量的增加而升高，当料液比为1∶6时，小麦籽粒中的DON的去除率接近50%，全麦粉中DON去除率为67%左右，这可能是由于DON大多集中于表面并且易溶于水[25]。

注：料液比的大小与加水量的多少呈正比,小麦籽粒、全麦粉中初始DON含量为(5.66±0.01) mg/kg。图4 料液比对小麦中DON的去除效果

由图5和图6可知，当用臭氧处理不同料液比的小麦籽粒和全麦粉时，DON的降解效果随着料液比的增大而升高，且随着臭氧质量浓度的增加也呈现升高的趋势，在料液比为1∶6时，经过质量浓度为80 mg/L的臭氧处理60 min后，小麦籽粒中DON的降解率可达41%，全麦粉可达45%。有研究用不同料液比的臭氧水降解小麦中的DON，发现随着料液比的增大，以及臭氧水浓度的升高，DON的降解率显著升高，说明了臭氧和·OH的量增加，有利于DON的降解，且臭氧水浓度越高，DON与臭氧分子接触越充分，生成的·OH也越多，因而降解作用越强[26]。

由图5可知，当料液比由1∶4变至1∶6时，臭氧对小麦籽粒中DON的降解率不再升高，这可能是因为在实验的过程中这两种加水量的液面都能没过籽粒，水与籽粒的接触面积几乎一致，因此，即使加水量增加，DON的降解率变化也不显著。由图6可知，与小麦籽粒不同的是，随着料液比增加到1∶6时，臭氧对全麦粉中DON的降解率依旧呈现升高的趋势，这可能是因为全麦粉与水混合后，变成了混合物，加水量越多，全麦粉在臭氧处理过程中与臭氧接触机会越大，因此降解率越高。

注：处理时间均为60 min,料液比为1∶1、1∶2、1∶4、1∶6的小麦籽粒中初始DON含量为(4.28±0.17)、(4.23±0.09) mg/kg，(2.72±0.33)、(2.61±0.21) mg/kg。图5 臭氧对料液比不同的小麦籽粒中DON的降解效果

注：处理时间均为60 min,料液比为1∶1、1∶2、1∶4、1∶6的全麦粉中初始DON含量为(5.63±0.45) 、(3.79±0.14) 、(2.38±0.23)、(1.82±0.13) mg/kg。 图6 臭氧对料液比不同的全麦粉中DON的降解效果

2.4 小麦组分对臭氧降解DON效果的影响

由图7可知，未加入组分的DON溶液的降解率远远大于加入3种组分的样品组，这3种样品组中，加入淀粉的样品组中DON的降解率最高，麸皮次之，蛋白最低，且加入淀粉和麸皮的样品组中DON的降解率均随着臭氧浓度的增加而升高，而加入蛋白的样品组的降解率呈现降低的趋势，并呈现负值，这表明臭氧会引起蛋白质多肽主链氧化、肽键断裂以及蛋白质交联等一系列变化[27]，此时，与小麦蛋白发生结合的DON从面筋网络中游离出来，导致样品溶液中的DON含量增加。由此可见，在臭氧降解小麦中的DON时，麸皮、淀粉和蛋白均对其降解效果有着明显的阻碍作用，且蛋白的阻碍作用最大。

图7 小麦组分对臭氧降解DON效果的影响

3 结论

臭氧可以在短时间内显著降解水溶液中的DON和固态DON，且臭氧对这两种状态下的DON纯品的降解率均随着臭氧处理浓度和处理时间的增加而升高；臭氧对全麦粉中DON的降解率显著高于小麦籽粒，对小麦粉和麸皮中DON也具有较好的降解效果，臭氧对接触面积大和水分含量高的样品中的DON的降解效果较好；臭氧对料液比不同的小麦籽粒和全麦粉有不同的降解效果，料液比增大，降解率也随之升高，当加水量液面超过小麦籽粒时，随着加水量的增加，小麦籽粒降解率不再升高，而全麦粉的降解率一直处于升高趋势。本研究还发现，臭氧对DON纯品的降解效果远远高于赤霉病小麦，这其中主要是小麦蛋白对其降解效果起到明显的阻碍作用。

臭氧对不同基质中的DON的降解效果不同，在臭氧降解DON的过程中，可通过适当提高臭氧的处理浓度和处理时间、增大臭氧与样品的接触面积、以及在合理范围内提高样品的水分含量，防止样品结块，来提高臭氧对DON的降解效果。此外，小麦组分对臭氧降解DON有明显的阻碍作用，因此，在未来的研究中，应着重于小麦组分对臭氧降解DON的影响规律及其机理方面的研究，为DON的臭氧降解技术的改进提供参考。