静电场辅助冷冻对面筋蛋白品质及分子结构的影响

张艳艳 王冰蕊 丁江涛 刘兴丽 王宏伟 张 华

(郑州轻工业大学食品与生物工程学院；食品生产与安全河南省协同创新中心；河南省冷链食品质量安全控制重点实验室，郑州 450002)

冷冻面团技术不仅可以有效地提高冷冻面制品的标准化，还能满足人们对食品新鲜度的高要求[1]。然而常规的冷冻方式在冷冻过程中会产生较大冰晶，破坏面筋蛋白的网络结构，导致面团持气性下降，从而引起面制品的品质劣变，如体积变小、黏弹性降低、蒸煮后口感差、褐变、微生物超标等问题[2,3]。因此，探究改善冷冻面制品品质的方法，具有极其重要的意义。静电场是一种新型的非热技术，具有设备成本低、操作简单等优势。其作用机制是在低温环境下，通过电场扰动形成均匀的细小冰晶，从而减少冰晶对细胞结构的破坏[4]。在无静电场作用下，由于水分子的偶极矩方向是任意的，冰晶在不同方向上生长的概率相同。施加静电场后，沿静电场方向冰核形成的概率最大，且冰晶生长主要沿电场方向进行(图1)，其他方向分布的水分子需要克服较大的位阻实现液-固的转变，因此起到抑制冰晶生长的作用，降低冰晶的生长速率[5]。

图1 静电场的作用机制图

高文宏[6]研究发现静电场对葡萄糖和蔗糖溶液中冰晶的生长都有不同程度的抑制作用，使得相变时间有所延长，在电场辅助冷冻过程中对食品产生积极影响，有利于维持食品较高的品质特征。尚柯等[7]研究发现，静电场辅助冻结牛肉能显著缩短肉样通过最大冰晶生成带所用的时间，冰晶的体积小且均匀。Xanthakis等[8]研究静电场辅助冷冻对猪肉的影响，结果发现静电场辅助冷冻下形成冰晶的尺寸显著减小，从而降低了对肉样微观结构的损害。

小麦面筋蛋白在面团强度、延展性和气体滞留性方面起着决定性作用，其性能与面团的最终食用品质密切相关，因此，冷冻过程中面筋蛋白网络结构的破坏，是影响面团品质劣变的主要原因之一[9]。本实验将低频交变电场施加到湿面筋蛋白体系的冷冻过程，研究其对面筋蛋白流变特性、水分分布和热力学特性的影响；在分子水平上探究静电场对面筋蛋白品质的改善作用，并采用激光显微共焦拉曼光谱仪对其分子结构变化进行原位分析。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

小麦粉(蛋白质11.10%，含水量11.34%)；三羟甲基氨基甲烷(Tris)、甘氨酸、5,5′-二硫代双-2-硝基苯酸(DTNB)、尿素、牛血清蛋白、Folin-酚试剂等：分析纯。

1.2 仪器与设备

JJJM54S 面筋洗涤仪，Discovery旋转流动仪，DSC-Q20差式扫描量热仪，HWS-080恒温恒湿醒发箱，NMI-20低场核磁共振成像分析仪，LGL-50FD冷冻干燥机，TU-1810 PC紫外可见分光光度计，inVia激光显微共焦拉曼光谱仪。

1.3 方法

1.3.1 电场辅助冷冻面筋蛋白

参考赵雷[10]面筋蛋白的提取方法并略有修改。准确称取10 g小麦粉，缓慢倒入面筋洗涤杯中，加入4.5 mL质量浓度为2%的NaCl溶液，设置和面时间40 s，先用2%NaCl溶液洗涤3 min，再用蒸馏水洗涤2 min。洗涤完成后取出面筋蛋白，每个面筋蛋白样品取3.5 g放入自封袋中备用。

将制备好的面筋蛋白置于温度为-18 ℃、型号相同且放在同一环境下的施加电场和未施加电场的冰箱中冷冻，电场电压分别为300、600、900 V，使用多路温度测定仪实时监测样品中心温度，当样品中心温度达到-18 ℃并稳定60 min时，取出样品。取部分样品置于30 ℃的恒温恒湿箱解冻30 min后用于直接测定水分分布和流变特性，剩余样品冷冻干燥后研磨，过100目筛，得到小麦干面筋蛋白粉。

注：1.静电场总电源，2.电冰箱，3.电场板，4.置物架，5.面筋蛋白。图2 静电场辅助冷冻面筋蛋白装置图

1.3.2 面筋蛋白流变学特性的测定

根据王沛[11]的方法并稍作改动。将不同强度下电场辅助冷冻的面筋蛋白解冻后，放置在旋转流变仪的底板上，进行面筋蛋白流变学特性的测定。

1.3.3 面筋蛋白热特性的测定

根据Huang等[12]的方法并稍作修改。准确称取2～3 mg冻干面筋蛋白样品，密封好加入DSC小铝锅中。以5 ℃/min的速度从25 ℃升到100 ℃。变性峰值温度(Tp)和焓值(ΔH)采用TA系统中的Muse软件分析计算。

1.3.4 面筋蛋白化学作用力的测定

参考Wang等[13]、Li等[14]、冷利萍[15]的方法，并稍作改动。取0.2 g冻干的面筋蛋白粉末分别与10 mL的0.05 mol/L NaCl(SA)、0.6 mol/L NaCl(SB)、 0.6 mol/L NaCl+1.5 mol/L尿素(SC)、0.6 mol/L NaCl+8 mol/L尿素(SD)以及0.6 mol/L NaCl+8mol/L尿素+1.5 mol/L尿素(SE)溶液混合，并在1 600 r/min离心均质15 s后，在4 ℃的条件下静置1 h，于8 000 r/min离心20 min，取上清液测定其吸光度。用Folin-酚法测定上清液中蛋白质含量。离子键、氢键、疏水相互作用、二硫键的贡献分别以溶解于SB溶液与SA溶液、SC溶液与SB溶液、SD溶液与SC溶液、SE溶液与SD溶液中蛋白质含量之差表示。

1.3.5 面筋蛋白分子结构的分析

采用激光显微共焦拉曼光谱仪对面筋蛋白的二级结构、二硫键构型等分子结构进行原位分析。将冷冻干燥后的面筋蛋白，切成适当大小的方块后，置于载玻片上，用激光显微共焦拉曼光谱仪进行成像。成像参数为：激发波长785 nm，扫描面积1 000 μm ×1 000 μm，步长4 μm。对采集到的拉曼光谱的蛋白质二级结构(1 600～1 700 cm-1)和二硫键构型(500～550 cm-1)谱带区间进行分析成像。

1.3.6 面筋蛋白的扫描电子显微镜观察

将冷冻干燥后的面筋蛋白，切成适当大小的方块后，喷金后贴于置物台上，用扫描电子显微镜观察样品的微观结构。

1.4 数据统计分析

采用Origin 8.5进行数据整理和作图，SPSS 17.0软件进行显著性检验(P<0.05)。实验重复3次取平均值，数据用平均值±标准偏差表示。

2 结果与分析

2.1 静电场辅助冷冻对面筋蛋白流变特性的影响

由图3可知，当电压强度为300～600 V时，弹性模量和黏性模量呈增加趋势，而当电压强度为600～900 V时，G′、G″又开始降低。这可能是因为低强度电压辅助冷冻处理后，可减少由于冰晶损伤所引起的非共价键的断裂，且能减少大分子蛋白质聚合物的结构损伤，而高强度的电压会损害面筋蛋白的网络结构。损耗角正切值tanδ=G′′/G′，弹性模量均大于黏性模量(tanδ 值小于1)，表明面筋蛋白复合体系介于黏性液体与弹性固体之间，具有类固体特性。在不同的电场强度下，面筋蛋白的tanδ 呈先增加后降低的趋势，当静电场的强度为600 V时，tanδ 值达到最大，这说明施加600 V的静电场对面筋蛋白弹性的贡献大于黏性，这有利于谷蛋白分子之间形成交联结构，能更好地赋予面团弹性[16]。

图3 静电场辅助冷冻对面筋蛋白流变特性的影响

2.2 静电场辅助冷冻对面筋蛋白热特性的影响

面筋蛋白的热力学性质是反映面筋强度的重要特征，热变性温度(Tp)和变性焓(ΔH)是评估面筋蛋白热稳定性的主要参数[17]。由表1可知，与对照相比，不同强度下电场辅助冷冻的面筋蛋白样品的Tp和ΔH均增加。Tp可用于评价物质的分子流动性和水化程度，当某种物质解聚时，其热变性的温度将降低，这说明施加静电场后，面筋蛋白的低热稳定性提高，且减缓了冷冻对面筋蛋白网络的空间结构的破坏[18]。ΔH反映面筋蛋白有序化结构的高低，由表1可以看出，随着电场电压的升高，面筋蛋白的ΔH呈先增加后降低的趋势，且ΔH分别增加0.088、0.252、0.115 J/g。有研究表明，冷冻后面筋蛋白的ΔH降低，则面筋蛋白的有序结构减少，而施加300 V的静电场后，面筋蛋白的有序性相对较高[19]。这可能是静电场会抑制水分子的扩散运动，从而抑制冰晶的生长，而当电压过高时，又会对面筋蛋白的网络结构造成一定程度的破坏。

表1 静电场辅助冷冻对面筋蛋白热特性的影响

2.3 静电场辅助冷冻对面筋蛋白化学作用力的影响

维持蛋白质三级网络的化学作用力有离子键、氢键、疏水相互作用等，而二硫键是稳定面筋蛋白网络结构的重要化学键，麦谷蛋白通过链内和链间二硫键形成三维网络结构的蛋白骨架，而醇溶蛋白通过氢键和疏水性共价键镶嵌在麦谷蛋白网络中[20]。如图4所示，与传统冷冻方式相比，施加静电场后氢键的含量呈先降低后增加的趋势，离子键、疏水相互作用和二硫键的含量则相反。氢键含量的减少可能是因为在冷冻过程中，静电场会扰动水分子间氢键的形成，使冷冻过程中形成的冰晶较小且分布均匀，进而减少冷冻过程中冰晶对面筋网络结构的破坏。疏水相互作用的增加可能是因为在静电场的作用下，面筋蛋白的疏水性基团发生暴露，促使疏水相互作用增强，而电场强度过高时，由于蛋白质空间结构的改变，更多的疏水性氨基酸暴露，且生成了更复杂的结构，导致疏水相互作用减弱[21]。300 V的静电场处理后，使巯基不断地暴露和逐渐氧化，因此二硫键含量增加，而当静电场电压增大时，又会引起蛋白中二硫键的断裂，从而引起二硫键含量的下降。静电场作用下离子键的含量也显著增加，这表明施加静电场对冷冻过程中离子键的含量和疏水相互作用具有一定保护作用。

图4 静电场辅助冷冻对面筋蛋白化学作用力的影响

2.4 静电场辅助冷对面筋蛋白分子结构的影响

研究面筋蛋白的2个主要区域，分别是1 600～1 700 cm-1(酰胺I带)和500～550 cm-1(二硫键)。酰胺I带(1 600～1 700 cm-1)是表征蛋白质的二级结构变化的一种有效方法。对二级结构的归属为：α-螺旋(1 645～1 660 cm-1)，β-转角(1 640～1 645 cm-1、1 680～1 690 cm-1)，无规则卷曲(1 660～1 670 cm-1)，β-折叠(1 670～1 680 cm-1)[22]。面筋蛋白中二级结构的变化如图5所示，在300、600 V的静电场电压处理后，面筋蛋白各二级结构单元的分布更加均匀，当静电场电压为300 V时，α-螺旋的含量增加，这说明冷冻过程中面筋蛋白网络结构的稳定性增强，而当静电场电压增加到600 V以后，面筋蛋白中β-转角和无规卷曲的含量增加，且电压为900 V时各二级结构单元又产生聚集，这是因为高静电场电压导致面筋蛋白的结构无序化。

注：黄色、蓝色为β-转角，红色为α-螺旋，绿色为无规则卷曲，水绿色为β-折叠。图5 静电场辅助冷冻面筋蛋白二级结构的共聚焦显微拉曼图

在拉曼光谱中，500～550 cm-1是S-S的特征振动谱带，510 cm-1附近的谱峰归属于gauche-gauche-gauche(g-g-g)构型，536 cm-1附近的谱峰归属于trans-gauche-trans(t-g-t)构型，其中g-g-g构型是面筋蛋白中最主要的、能量最稳定的构型[23]。如图6所示，施加静电场后面筋蛋白中g-g-g构型含量呈现先增加后减少的趋势。当静电场电压为600 V时，面筋蛋白中的g-g-g构型的含量最多，这说明一定强度的静电场电压有利于面筋蛋白网络状结构的稳定。

注：红色为g-g-g构型，绿色为t-g-t构型。图6 静电场辅助冷冻面筋蛋白的二硫键构型的共聚焦显微拉曼图

2.5 静电场辅助冷冻对面筋蛋白微观结构的影响

图7为面筋蛋白网络结构的变化。对照组中面筋蛋白的网络结构疏松，孔洞较大且分布不均匀，而静电场辅助冷冻处理后的面筋蛋白的网络结构较对照组有所改善，孔径更小且分布均匀。这是因为在静电场的作用下，相变初期容易形成冰核，且在冰晶的生长阶段抑制水分子进行液—固转变，从而降低冰晶的生长速度，使得冷冻过程中冰晶的大小和分布更加均匀，减少了冰晶体积增大对面筋蛋白网络结构的破坏[24]。

图7 静电场辅助冷冻面筋蛋白微观结构的影响(200×)

3 结论

研究不同静电场电压辅助冷冻对面筋蛋白品质及分子结构的影响，结果表明低电压静电场辅助冷冻有利于提高面筋蛋白的黏弹性和热特性。化学作用力结果表明，当300 V静电场电压辅助冷冻面筋蛋白的疏水相互作用和二硫键含量增加，且激光共聚焦拉曼图反映300、600 V的静电场促进面筋蛋白的二级结构单元分布更加均匀且二硫键构型中g-g-g构型的含量增加，面筋蛋白微观结构的观察结果也进一步证明了300、600 V的静电场电压对面筋蛋白的网络结构、黏弹性和热特性的有效改善作用。而静电场的电压为900 V时，过大的电压强度会破坏分子中的二硫键，造成面筋蛋白网络结构的塌陷。因此，低电压的静电场辅助冷冻处理可以通过减少冷冻过程中冰晶的尺寸且使其分布更加均匀，有效地减少冷冻对面筋蛋白网络的破坏作用。