超高压预处理对TGase交联的大豆分离蛋白凝胶的影响

史乾坤 王心雅 甄 诺 牛 希周东方 张 浩 赵城彬 刘景圣

(吉林农业大学食品科学与工程学院;小麦和玉米深加工国家工程实验室1，长春 130118)(南方医科大学药学院2，广州 510515)

大豆分离蛋白(Soybean protein isolate，SPI)由于具有较高的营养价值、功能特性和相关的健康效应，在食品制造中得到了广泛的应用。SPI是一种来自大豆的具有高品质的植物蛋白[1]，SPI含有至少90%的蛋白质[2]，在食品工业中，如婴儿配方奶粉、豆腐、肉类和乳制品中，SPI的胶体特性得到了广泛的应用[3]。然而，未经改性修饰的SPI表现出较差的凝胶性能。因此研究对其进行改性处理以提高SPI的功能特性。

转谷氨酰胺酶(Transglutanminase，TGase)通过催化赖氨酸残基的ε-氨基与谷氨酰胺残基的γ-酰胺基团之间的酰基转移使蛋白质发生交联反应，形成共价ε-(γ-谷氨酰)赖氨酸异肽键[4]。TGase可改变食源性蛋白的结构和进而改善凝胶特性，包括大豆分离蛋白、猪肉肌原纤维蛋白、鸡肌原纤维蛋白和鱼类肌球蛋白[5-8]。SPI经TGase酶交联后，形成的凝胶网络通过共价键(例如二硫键)和分子间ε-(γ-谷氨酰基)赖氨酸交联连接[9]，TGase改性大豆蛋白具有较好的冻融稳定性[10]。SPI包含大量的赖氨酸，但赖氨酸残基由于大豆分离蛋白紧凑的结构而埋在SPI分子中，从而限制了酶催化的效率。改性后的SPI裸露出大量的酶结合位点，经TGase交联作用可能促进共价ε-(γ-谷氨酰)赖氨酸键的形成[11]。因此，适当的加工预处理可以促进蛋白质结构的展开以及相关酶作用位点的暴露，促进TGase交联反应。

超高压(Ultra-high pressure，UHP)是一种新的非热技术，在食品加工业中引起了广泛的关注。超高压可以改变蛋白质的构象，导致蛋白质变性。超高压对蛋白质改性程度，取决于蛋白质的种类、温度和压强大小以及保压时间[12，13]。

已有研究结果表明超高压对蛋白质修饰的影响。例如，He等[14]研究发现，与热处理油菜分离蛋白相比，超高压处理的油菜籽分离蛋白中可溶性蛋白聚集量较高，这可能与凝胶的质构特性得到改善有关。同样，Zhu等[15]研究报道了超高压处理下鱼糜的展开肌原纤维结构干扰了二硫键的形成和纤维基质的生长。这些研究表明蛋白质结构可能通过超高压处理而变化。此外，进一步的研究表明，压力可以改变蛋白质的二级、三级和四级结构。超高压(300～700 MPa)可以通过破坏蛋白质的二级结构来诱导完全变性。在稍低的压力(>200 MPa)下，蛋白质三级结构可能受到疏水键和二硫键的影响，而在低压(150～200 MPa)下，通过氢键的形成来维持蛋白质的四级结构[16]。高压均质作用能够提高SPI乳液体系的稳定性、流变学性质和氧化稳定性[17]。

UHP预处理复合TGase酶交联可以改善SPI的凝胶性能。因此，本实验研究超高压预处理(100～500 MPa)对TGase诱导的SPI凝胶结构和凝胶性能的影响，以期为超高压在豆腐、奶酪、肉蛋白和蛋白质饮料等食品蛋白质加工系统中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大豆分离蛋白(≥90%)、TGase(BR，200 U/g)、十二烷基硫酸钠(99%)、Tris(98%)、二硫硝基苯甲酸(99%)，其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

Alpha1-4LDplus冷冻干燥机，Phenom台式扫描电镜，VERTEX 70傅里叶红外光谱仪Q2000差示扫描量热仪，DZ400/2SB真空包装机，HPP600 MPa/30 L超高压食品处理设备。

1.3 方法

1.3.1 大豆分离蛋白的超高压处理

称取一定量大豆分离蛋白粉溶解于蒸馏水中，配成质量分数为5%的溶液，置于五层聚乙烯塑料袋(耐高温高压挠性塑料袋)中，以真空包装机紧密密封，不留气泡。将包装好的溶液在25 ℃条件下，分别在100～500 MPa压力下进行处理。

1.3.2 巯基含量的测定

参照Qin等[18]方法稍作修改，将经过超高压处理前后的大豆分离蛋白样品稀释到1 g/L，取稀释样品1 mL，加入2.0 mL的Tris-甘氨酸缓冲溶液(pH 8.0，含有10.4 gTris，6.9 g甘氨酸，1.2 g EDTA/L)和0.02 ml质量浓度为4 g/L的Ellman试剂(此试剂含有4 g DTNB/L，用pH 8.0 Tris-甘氨酸缓冲溶液配制)，25 ℃保持20 min，采用分光光度计在412 nm处测定吸光值。实验以不加蛋白液，而加Ellman试剂为空白。按照式(1)计算-SH的含量。

-SH=(73.53×A412×D)/C

(1)

式中：A412为有DTNB存在时蛋白液的吸光值减去无DTNB存在时蛋白液的吸光值；D为蛋白液的稀释倍数；C为蛋白液的质量浓度/g/L。

1.3.3 热特性分析

样品的热特性通过差示扫描量热仪(DSC)测定。参考张浩等[19]的方法稍加修改，取3 mg样品于铝盘中，压片并以空铝盘为对照。以10 ℃/min的升温速率由20 ℃升至200 ℃，氮气流速为50 mL/min。记录此过程的起始温度(Ti)、峰值温度(Td)、终止温度(Tf)和热焓变(ΔH)。使用TA仪器通用分析软件得到的热曲线，计算出样品的变性温度。

1.3.4 粒径分析

使用Malvern Mastersizer 2000测量粒径分布和平均粒径。将处理和未处理的蛋白质溶液用磷酸盐缓冲液(0.01 mol/L，pH 7.0)稀释至蛋白质的质量浓度为1 g/L，取1 mL进行粒径分析。

1.3.5 荧光光谱

内源荧光光谱法参考Liu等[20]的方法并进行了修改。通过添加磷酸盐缓冲液将样品稀释至蛋白质的质量浓度为0.5 mg/mL。以600 nm/min的扫描速度进行荧光光谱扫描，激发波长为280 nm，发射波长为300～550 nm，狭缝宽度为15.0 nm。

1.3.6 TGase诱导的SPI凝胶的制备

冻干SPI配成质量浓度为9 mg/100 mL的溶液，室温搅拌1 h。添加20 U/mL溶液的TGase，快速搅拌10 s，最终TGase和SPI浓度分别为30 U/g，SPI的质量浓度为9 mg/100 mL。混合物在40 ℃下反应2 h，在90 ℃下灭活10 min，然后4 ℃过夜。

1.3.7 傅里叶红外光谱

干燥条件下，将1 mg凝胶样品与0.1 g溴化钾用玛瑙研钵充分研磨成均匀粉末，使用手动压力机压制成薄片，然后进行全波段扫描(4 000～400 cm-1)，扫描次数为64次，分辨率为4 cm-1，测定温度为25 ℃。测定傅里叶变换红外光谱曲线。

1.3.8 凝胶质构分析

参照Qin等[18]的方法，采用TA-XT2质构仪对凝胶强度进行测定。将凝胶样品放于测量台上，采用P/0.5探头，选择TPA模式，设置压缩前、压缩中、压缩后的速度分别为3.0、2.0、3.0 mm/s，凝胶压缩比例为35%，2次下压间隔5 s，触发力为5 g。测定后得质构参数，凝胶强度以探头下压过程中的最大感应力表示。

1.3.9 持水力(WHC)测定

参照Zhao等[21]的方法，称取5 g蛋白凝胶置于50 mL离心管中，4 ℃、5 000 r/min离心15 min后除去水分，测定离心管中凝胶离心前后的质量。每个样品进行3次平行实验。持水性按照式(2)计算。

(2)

式中：m0为离心管质量/g；m1为离心前离心管和凝胶质量/g；m2为离心后离心管和凝胶质量/g。

1.3.10 NMR自旋-自旋弛豫时间测定

参照田海娟等[22]的方法。测试参数为：回波时间100 μs，8 000个回波，重复扫描32次，重复扫描间隔时间为3 000 ms，得到的信号衰减曲线为指数衰减曲线，利用核磁共振弛豫时间反演拟合软件Ver4.09进行反演。

1.3.11 微观形貌分析

参照Kahwa等[23]的方法，采用扫描电子显微镜观察凝胶样品的微观结构形貌，干燥的样品用双面导电胶固定在样品台上，用洗耳球轻吹样品表面使样品单层铺于样品表面，然后离子溅射喷金，置于扫描电镜观察台上进行微观结构观察。设置加速电压为5 kV。

1.3.12 数据处理

每组实验重复测定3次，用Origin 8.5和Graphpad prism 6.0绘制图像，采用SPSS22.0统计软件进行ANOVA差异显著性分析，P<0.05为显著性差异。

2 结果与分析

2.1 热特性分析

采用差示扫描量热仪对经超高压处理前后的大豆分离蛋白的热特性进行分析，结果如图1所示。与未经超高压处理的大豆分离蛋白相比，超高压处理后的的样品在吸收峰位置发生偏移。DSC热力学参数见表1，当温度在100～120 ℃时，样品的吸收峰，分别为114.97、112.98、110.44、114.95、105.94、115.85 ℃，而超高压处理之后样品的ΔH与对照组相比均显著提高(P<0.05)，分别为263.40、262.70、271.90、274.50、236.94 J/g，其中对照组为201.03 J/g，并且随着压强的增加而增大，说明超高压改性后的大豆分离蛋白需要更多的热量使蛋白质性质发生改变。但是当压强为500 MPa时，热焓值相比400 MPa时下降37.60 J/g，这是由于蛋白结构破坏较严重，不需要更多的热量来破坏氢键以释放水，表明与水的结合力不如400 MPa强。

图1 超高压处理前后大豆分离蛋白的DSC热分析图

表1 超高压处理大豆分离蛋白的DSC热力学参数

2.2 游离巯基含量

游离SH作为蛋白质分子表面的反应性功能基团，对蛋白质凝胶化的特性产生较大影响。如图2所示，超高压处理之后的SPI游离SH在100～400 MPa呈上升趋势，而500 MPa时的含量比400 MPa时低，可能是当压强达到500 MPa时，使得蛋白质聚集，部分的巯基包埋在聚集体中，这一结果与Chen等[24]得到的结果一致。此外，Li等[25]的研究结果推测UHP处理诱导了SPI的部分展开和变性。这种蛋白的展开可能会通过UHP处理暴露出游离SH和埋在蛋白内部的疏水残基，从而导致游离SH增加。

注：不同字母代表有显著性差异(P<0.05)，下同。图2 不同超高压预处理水平对大豆分离蛋白游离巯基含量的影响

2.3 粒径分析

如图3所示，与实验组相比，未处理过的蛋白质显示出较小尺寸分布。与未经处理的蛋白质相比，100～300 MPa处理后的蛋白质粒径增加，经100 MPa处理的大豆分离蛋白具有较宽的粒径分布，表明超高压处理可以有效地改变蛋白质的粒径。可能是由于超高压作用破坏非共价键，例如氢键和蛋白质颗粒之间的疏水相互作用并改变天然蛋白质的聚集状态[26]。但是，在400、500 MPa超高压处理后，蛋白质粒径减小，这表明在强力超高压处理对蛋白质结构破坏程度较高，改善了大豆分离蛋白的粒径大小。

图3 不同超高压预处理水平大豆分离蛋白的粒径分布

2.4 荧光分析

内在荧光主要来自色氨酸和酪氨酸残基，它们对微环境的变化非常敏感。通过观察荧光强度来反映蛋白质结构的变化[27]。从图4可以看出，实验组的荧光强度高于未处理样品的荧光强度。随着超高压强度的增加，实验组荧光强度先降低后升高，在400 MPa时达到最低，500 MPa时最高。原因可能是超高压理破坏了蛋白质结构，导致蛋白质的不同的伸展和折叠结构造成的，从而削弱了溶剂的猝灭作用。

图4 不同超高压预处理水平蛋白质荧光强度的变化

2.5 超高压处理对大豆分离蛋白的二级结构的影响

表2是大豆分离蛋白经超高压处理前后蛋白凝胶二级结构含量变化的对比。经超高压处理之后蛋白质的二级结构含量发生了显著的变化，β-折叠和无规则卷曲含量增多，α-螺旋和β-转角减少。与未经过超高压处理的大豆分离蛋白相比，经过超高压处理蛋白质的α-螺旋、β-转角、β-折叠和无规则卷曲存在显著性差异(P<0.05)，这一结果与Qin等[3]结果一致。由此可以看出，超高压处理TGase交联会使大豆分离蛋白的二级结构发生一定的改变。

表2 保压时间为10 min时蛋白质二级结构含量

2.6 质构特性

表3总结了大豆分离蛋白凝胶的TPA结果，包括7个参数：硬度、黏度、弹性、内聚性、黏性、咀嚼性和弹力。随着压强从0增至400 MPa，硬度、黏性、内聚性、咀嚼性和弹力值达到最大值，分别为729.10、554.87、0.74、230.46、0.54；然后增加到500 MPa时的除了弹性值增大，其他值都相对400 MPa时减小。400 MPa与对照组相比，硬度，黏度，弹性，内聚性，黏性，咀嚼性和弹力之间均存在显著性差异。UHP处理过的凝胶最初的凝胶硬度随压力水平的升高先升高后降低，在400 MPa达到最大值并达到729.21 g，这些结果与蛋白质的预期变性和展开相吻合[14]。TPA结果表明，超高压对大豆分离蛋白凝胶的凝胶的质地特性有很大影响，在一定程度上可以改善凝胶性质。

表3 大豆分离蛋白凝胶的质构参数

2.7 持水力测定

持水力(WHC)反映了凝胶系统中蛋白质和水两者之间的相互作用能力。蛋白质的展开促进了TGase诱导的反应并导致SPI凝胶网络结构具有稳定的均匀性和密度。此外，均匀而致密的微观结构可能会结合蛋白质凝胶中的水，有助于增强WHC。此外，这些结果可能与TGase处理SPI后疏水残基的暴露增加以及二硫键的形成有关。图5显示了在不同超高压处理条件下蛋白质凝胶的保水能力。可以看出，处理过的蛋白质凝胶的保水能力均有不同程度的提高。在100～400 MPa范围内处理大豆分离蛋白，形成的凝胶持水性是成递增趋势的，在400 MPa时最大，其凝胶保水率达到92.27%，是未经处理的1.28倍。图5中的数据表明，达到500 MPa的最高压力水平时，可能是过高的压力水平导致蛋白之间交联结构破坏过度导致持水能力下降，结果与Ma等[17]报道的一致。

图5 不同超高压预处理水平对TGase交联大豆分离蛋白凝胶持水能力的影响

2.8 凝胶内部的水分分布以及水分迁移

大豆分离蛋白凝胶的T2横向弛豫时间如图6所示，分布在0.1～1 000.0 ms之间，出现了3个特征峰，其中T21(0.1～35.0 ms)区间是蛋白质分子中极性基团与水以氢键形式结合的水，键能较大，不易断开，该区间的水称为结合水；T22(35～180 ms)区间为蛋白质分子中的酰胺基与水以较小键能结合，为蛋白凝胶中多分子层水，与蛋白结合程度相对较差，是被凝胶网络结构束缚的水分，被认为是不易流动的水；T23(180～1 000 ms)区间为自由水，即蛋白样品凝胶过程中未束缚进网络结构的水，附着在蛋白凝胶的表面。大豆分离蛋白凝胶的自由水含量变化如图7所示。在100～400 MPa范围内随着压强的增加，随着压强的增加，在400 MPa时自由水比例最小，达到94.48%，另外这是由于大豆分离蛋白更多的二级结构被打开，游离巯基含量增多，导致结合水的能力增加，导致自由水含量减小。但再增加压强达到500 MPa时，自由水为96.36%，这是由于压强增大使形成的凝胶网络结构不够稳定，导致半结合水减少，自由水增多。

图6 不同超高压预处理水平对TGase交联大豆分离蛋白凝胶T2弛豫时间的影响

图7 不同超高压预处理水平对TGase交联大豆分离蛋白凝胶自由水含量的影响

2.9 微观形貌分析

用扫描电子显微镜以表明不同的超高压处理对TGase诱导的大豆分离凝胶的三维网络微观结构的影响。凝胶的微观结构是其性能的重要决定因素，例如凝胶强度和WHC。图8显示了在不同压力水平(0～500 MPa)后TGase诱导的大豆分离蛋白凝胶的一系列显微图像。可以看出未加压处理蛋白形成的凝胶表面结构致密，成块状卷曲，而在100～500 MPa下加压处理之后形成的大豆分离蛋白凝胶表面结构发生疏松的变化，且随着压强的增加，凝胶表面结构更加疏松，破碎程度增加，是由于相关的UHP处理，促进了大豆分离蛋白结构的展开和TGase交联，凝胶网络变化的另一个可能原因可能是超高压处理增加了大豆分离蛋白凝胶的断裂力，断裂活性和断裂位移[17]。

图8 不同超高压预处理水平对TGase交联大豆分离蛋白凝胶的扫描电子显微镜图

3 结论

对大豆分离蛋白进行超高压处理后，对大豆分离蛋白进行热特性分析，结果表明随着压强的增加，热焓值大小呈上升趋势，在压强达到400 MPa时，热焓值最大。超高压处理之后的SPI游离SH在100～400 MPa呈上升趋势，在400 MPa时达到最大。对超高压预处理TGase诱导交联的大豆分离蛋白凝胶进行分析，结果表明，TGase交联的大豆分离蛋白凝胶的二级结构发生一定的改变，β-折叠含量和无规则卷曲含量增加，α-螺旋和β-转角含量减少；凝胶的持水能力得到提升，自由水比例减少，结合水含量增多，从而引起理化性质的改变。此外，经过超高压处理后的TGase诱导交联的大豆分离蛋白凝胶的质构特性也得到了较好的改善。本研究结果可以为在食品蛋白凝胶化行业中扩大大豆分离蛋白的利用方面提供一定的理论支持。