Notch1 信号通路对肺腺癌细胞侵袭和顺铂耐药的影响及其机制

陈立松 ,房 惠 ,王鹤霏 ,何程远 ,盖晓东 ,历 春

（1.北华大学基础医学院分子医学实验室，吉林 吉林 132013；2.中南大学湘雅第三医院妇科，湖南 长沙 410013）

非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）占肺癌的80%～85%，其中肺腺癌占NSCLC 的40%～50%，其发病率逐年上升，且进展快，预后差［1］。肿瘤细胞的侵袭转移和对化疗药物的耐药作用是影响患者生存率的主要原因，也是肺腺癌治疗的难点。Notch1 是Notch 信号通路中的关键受体，在调节机体细胞生长发育和组织再生中均扮演重要角色［2］。研究［3-6］显示：Notch1 信号通路在乳腺癌和卵巢癌等多种肿瘤组织中异常活化，与肿瘤细胞的增殖、侵袭和耐药有密切关联。但Notch1 信号通路在肺腺癌侵袭转移中的作用及分子机制尚未完全阐明，其是否参与化疗耐药作用也尚不明确。因此，本研究通过γ-分泌酶抑制剂（DAPT）阻断Notch1 信号通路，观察肺腺癌细胞在侵袭、血管生成和上皮-间质转化（epithelial mesenchymal transitions，EMT）等方面的变化，以及其在顺铂耐药中的作用，以期为抑制肺腺癌侵袭转移和提高化疗效果提供有效的分子靶点。

1 材料与方法

1.1 细胞、主要试剂和仪器人肺腺癌细胞株A549 由北华大学基础医学院分子医学实验室保存；DMEM 高糖培养基（美国HyClone 公司），新生小牛血清（杭州四季青公司），Transwell 小室（美国Corning 公司），Matrigel 基质胶（美国BD 公司），基质金属蛋白酶9（metalloproteinase-9，MMP-9）和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒、小鼠抗人Notch1 和GAPDH 抗体（武汉博士德生物技术有限公司），CCK-8 试剂盒、小鼠抗人波形蛋白（Vimentin）、兔抗人Hes1、N-钙黏附蛋白（N-cadherin）、E 钙黏附蛋白（E-cadherin）和MDR 相关蛋 白1（MDR-associated protein 1，MRP1）（碧云天生物技术有限公司），P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）（武汉爱博泰克生物科技有限公司），顺铂（江苏豪森药业有限公司）。Western blotting 电泳设备（美国 Bio-Rad Laboratories 公司），全自动酶标仪（美国Bio-Tek公司）。

1.2 细胞培养A549 细胞用含有10%新生小牛血清和1%（V/V）青霉素-链霉素的高糖DMEM培养基于37 ℃、5% CO2的孵箱中培养。

1.3 Transwell 小室法检测各组A549 细胞中侵袭细胞数用Matrigel 胶包被Transwell 小室上室，以每孔6 × 104个细胞铺于Transwell 小室上室，上室分别加入终浓度为0、10 和20 μmol·L－1的DAPT 无血清DMEM 培养液200 μL，下室加入含10%血清的DMEM 培养液600 μL，每组设3 个复孔。37 ℃共培养24 h，棉签擦去上室细胞，PBS 缓冲液冲洗后苏木素染色，显微镜下观察并计算侵袭细胞数，以侵袭细胞数代表细胞迁移能力。

1.4 ELISA 法检测各组A549 细胞培养上清液中MMP-9 和VEGF 水平将A549 细胞以每孔5×105个细胞铺于6 孔细胞培养板中，每组设3 个复孔，次日于各组细胞内分别加入终浓度为0、10 和20 μmol·L－1的DAPT 培养液。培养72 h 后，取各组细胞培养上清液各1 mL，具体步骤严格按说明书操作。采用全自动酶标分析仪检测各孔在450 nm 波长处的吸光度（A）值，取平均A值，依标准品值制作标准曲线，计算MMP-9 和VEGF水平。

1.5 Western blotting 法检测各组A549 细胞中Notch1、Hes1、Vimentin、N-cadherin 和E-cadherin蛋白表达水平将A549 细胞以每孔5 × 105个细胞铺于6 孔细胞培养板中，每组设3 个复孔，次日于各组细胞内分别加入终浓度为0、10和20 μmol·L－1的DAPT 培养液。于48 h 收集各组细胞，RIPA 裂解液裂解细胞，BCA 法测定细胞总蛋白浓度，蛋白上样量为30 μg，10% SDS-PAGE 电泳、转膜，封闭后分别孵育抗Notch1（1∶300）、抗Hes1（1∶ 1 000）、抗E-cadherin（1∶1 000）、抗Vimentin（1∶1 000）和抗N-cadherin（1∶1 000）抗体4 ℃过夜。次日TBST 洗涤3 次，加入HRP 标记的二抗（1∶3 000）室温孵育1 h。加入ECL 显色底物，应用成像系统进行成像拍照，实验重复3 次。利用Image J 软件分析各条带灰度值，以目的蛋白条带灰度值/GAPDH 蛋白条带灰度值比值表示目的蛋白表达水平。

1.6 CCK-8 法检测各组A549 细胞生长抑制率将A549 细胞以每孔5×103个细胞接种至96 孔细胞培养板中，每组设3个复孔，次日于各组细胞内分别加入终浓度为0、10 和20 μmol·L－1的DAPT培养液，培养24 h 后各组细胞分别加入不同浓度的顺铂（0.625～5.000 mg·L－1）。继续培养48 h 后各组细胞分别加入CCK-8 试剂，每孔10 μL，2 h 后测定各孔在450 nm 波长处的A 值，实验重复3 次，取平均A值，计算细胞生长抑制率。细胞生长抑制率=（对照组A值－给药组A值）/对照组A值×100%。

1.7 Western blotting 法检测2 组A549 细胞中Notch1 和Hes1 蛋白表达水平将A549 细胞以每孔5×105个细胞接种至6 孔细胞培养板中，每组设3 个复孔，次日于各组细胞内分别加入0 和1.25 mg·L－1顺 铂。于48 h 收集各组细胞，采 用“1.5”中的方法检测和分析2 组A549 细胞中Notch1 和Hes1 蛋白表达水平。

1.8 Western blotting 法检测各组A549 细胞中P-gp 和MRP1 蛋白表达水平将A549 细胞以每孔5×105个细胞接种至6 孔细胞培养板中，每组设3 个复孔，次日于各组细胞内分别加入0 mg·L－1顺铂、1.25 mg·L－1顺铂、1.25 mg·L－1顺铂联合10 μmol·L－1DAPT。于48 h 收集各组细胞，采用“1.5”中的方法检测和分析各组A549 细胞中P-gp（1∶1 000）和MRP1（1∶1 000）蛋白表达水平。

1.9 统计学分析采用SPSS 17.0 统计软件进行统计学分析。各组A549 细胞中侵袭细胞数、上清液中MMP-9 和VEGF 水平、细胞中各蛋白相对表达水平和细胞生长抑制率均符合正态分布且方差齐，以表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，2组间样本均数比较采用两独立样本t检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组A549 细胞中侵袭细胞数Transwell 小室实验结果显示：与对照组 ［（157.00±16.52）个］比 较，10 μmol·L－1DAPT 组侵袭细胞数［（102.00±12.53）个］和20 μmol·L－1DAPT 组［（85.00±9.54）个］侵袭细胞数明显减少（P＜0.05 或P＜0.01）。见图1。

图1 Transwell 小室实验检测各组A549 细胞侵袭能力（苏木素，×400）Fig.1 Invasion abilities of A549 cells in various groups detected by Transwell chamber assay (Hematoxylin,×400)

2.2 各组A549 细胞上清液中MMP-9 和VEGF 水平ELISA 法检测结果显示：与对照组比较，10 和20 μmol·L－1DAPT 组MMP-9 和VEGF 水平均明显降低（P＜0.05 或P＜0.01）。见表1。

表1 各组细胞上清液中MMP-9 和VEGF 水平Tab.1 Levels of MMP-9 and VEGF in cell supernanant in various groups [n=3,,ρB/(μg·L－1)]

表1 各组细胞上清液中MMP-9 和VEGF 水平Tab.1 Levels of MMP-9 and VEGF in cell supernanant in various groups [n=3,,ρB/(μg·L－1)]

*P＜0.05，**P＜0.01 compared with control group.

2.3 各组A549 细胞中Notch1、Hes1 和EMT 相关蛋白表达水平Western blotting 法检测结果显示：与对照组比较，10 和20 μmol·L－1DAPT 组Notch1、Hes1、Vimentin 和N-cadherin 蛋白表达水平明显降低（P＜0.05 或P＜0.01），E-cadherin 蛋白表达水平明显升高（P＜0.05）。见图2 和表2。

表2 各组A549 细胞中Notch1、Hes1 和EMT 相关蛋白表达水平Tab.2 Expression levels of Notch1,Hes1 and EMT-related proteins in A549 cells in various groups (n=3，)

表2 各组A549 细胞中Notch1、Hes1 和EMT 相关蛋白表达水平Tab.2 Expression levels of Notch1,Hes1 and EMT-related proteins in A549 cells in various groups (n=3，)

*P＜0.05，**P＜0.01 compared with control group.

图2 Western blotting 法检测各组A549 细胞中Notch1、Hes1 和EMT 相关蛋白表达电泳图Fig.2 Electrophoregram of expressions of Notch1,Hes1 and EMT-related proteins in A549 cells in various groups detected by Western blotting method

2.4 各组A549 细胞生长抑制率CCK-8 法检测结果显示：与顺铂单独作用组比较，10和20 μmol·L－1DAPT 联合顺铂组的细胞生长抑制率明显升高（P＜0.05 或P＜0.01）。见表3。

表3 各组A549 细胞生长抑制率Tab.3 Inhibitory rates of growth of A549 cells in various groups（n=3,, η/%）

表3 各组A549 细胞生长抑制率Tab.3 Inhibitory rates of growth of A549 cells in various groups（n=3,, η/%）

*P＜0.05，**P＜0.01 compared with DDP group.

2.5 2 组A549 细胞中Notch1 和Hes1 蛋白表达水平1.250 mg·L－1顺铂作用A549 细胞48 h 后，Notch1 和Hes1 蛋白表达水平（0.77±0.08 和1.35±0.09）明显高于0 mg·L－1顺铂组（0.53±0.06 和1.03±0.10），组间比较差异有统计学意义（t=4.317，P＜0.05；t=3.986，P＜0.05）。见图3。

图3 Western blotting 法检测2 组A549 细胞中Notch1和Hes1 蛋白表达电泳图Fig.3 Electrophoregram of expressions of Notch1 and Hes1 proteins in A549 cells in two groups detected by Western blotting method

2.6 各组A549 细胞中P-gp 和MRP1 蛋白表达水平与0 mg·L－1顺铂组比较，1.250 mg·L－1顺铂组P-gp和MRP1蛋白表达水平明显升高（P＜0.01）；与1.250 mg·L－1顺铂组比较，1.250 mg·L－1顺铂联合10 μmol·L－1DAPT 组P-gp 和MRP1 蛋白表达水平明显降低（P＜0.01）。见图4 和表4。

表4 各组A549 细胞中P-gp 和MRP1 蛋白表达水平Tab.4 Expression levels of P-gp and MRP1 proteins in A549 cells in various groups (n=3，)

表4 各组A549 细胞中P-gp 和MRP1 蛋白表达水平Tab.4 Expression levels of P-gp and MRP1 proteins in A549 cells in various groups (n=3，)

*P＜0.01 compared with 0 mg·L－1 DDP group；△P＜0.01 compared with 1.250 mg·L－1 DDP group.

图4 Western blotting 法检测各组A549 细胞中P-gp和MRP1 蛋白表达电泳图Fig.4 Electrophoregram of expressions of P-gp and MRP1 proteins in A549 cells in various groups detected by Western blotting method

3 讨论

近年来研究［7］显示：异常的Notch1 信号通路与肿瘤的发生发展关系密切，细胞内Notch1 功能异常会导致未分化细胞向肿瘤细胞转化。30%的NSCLC 患者Notch1 信号通路异常活化［8］，其不仅参与NSCLC 细胞的生长、侵袭和转移，还导致NSCLC 患者的不良预后［9-11］。因此，阐明Notch1信号通路促进肺腺癌侵袭转移的分子机制，发现新的治疗靶点对肺腺癌的诊治具有重要意义。

肿瘤发生和转移是多因素多步骤的过程。其中，肿瘤细胞穿过细胞外基质（extracellar matrix，ECM）是肿瘤细胞侵袭转移的重要步骤。因此，本研究采用Transwell 小室侵袭实验，在上室铺基质胶模拟体内细胞外基质，检测DAPT 阻断Notch1 信号通路后对人肺腺癌细胞株A549 细胞侵袭能力的影响。本研究结果显示：阻断Notch1 信号通路可明显降低肺腺癌细胞穿越基质胶细胞数，表明Notch1 信号通路在肺腺癌细胞的侵袭过程中发挥重要作用。本研究结果与HUANG 等［12］在肺癌中的研究结果相符，通过Transwell 小室实验发现Notch1 过表达的H1993 肺癌细胞系可明显增加细胞迁移和侵袭的能力。

基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）是降解ECM 最重要的酶类，MMP-9 属于Ⅳ型胶原酶，在肿瘤的侵袭、转移和血管生成中发挥重要作用［13-14］。因此，本研究检测阻断Notch1信号通路后A549 细胞上清液中MMP-9 水平，结果显示：MMP-9 水平随DAPT 浓度的增加明显降低，表明Notch1 信号通路可能通过调控MMP-9 的表达促进肺腺癌细胞的侵袭。BIN HAFEEZ 等［15］报道的前列腺癌细胞中Notch1 和MMP-9 的关联支持本研究结果，前列腺癌细胞Notch1 敲除后MMP-9 的表达和活性呈浓度依赖性降低，提示Notch1 可能通过增强MMP-9 启动子活性直接调控其表达。

肿瘤细胞的侵袭转移离不开血管生成对其营养支持。VEGF 是最重要的促血管生成因子之一，能增加血管的通透性，刺激血管内皮细胞增殖，阻断VEGF 通路可明显抑制肿瘤的血管生成和转移［16］。ZANG 等［17］研究发现：过表达Notch1 的胃癌细胞可明显促进VEGF 的分泌和人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）的增殖。本研究结果显示：DAPT 处理A549 细胞后，VEGF 表达水平呈浓度依赖性下调，表明Notch1 信号通路可能通过促进肿瘤血管生成进而促进肺腺癌细胞的侵袭。

EMT 是肿瘤细胞发生侵袭转移的另一重要机制。在EMT 过程中，上皮细胞失去极性，转变成具有迁移能力的间质细胞。EMT 表型表现为上皮细胞失去上皮细胞标记物，如E-cadherin，并获得间质细胞标志物（Vimentin 和N-cadherin）的表达［18］。研究［19-21］表明：在乳腺癌和结肠癌等多种肿瘤中Notch1 信号通路可介导EMT 发生，从而促进肿瘤细胞的侵袭及转移。本研究结果显示：DAPT 处理A549 细胞后，Notch1 及Notch1 通路下游重要分子靶点Hes1 的表达明显下调，表明DAPT 处理可以阻断Notch1 信号通路；进一步研究显示：阻断Notch1 信号通路后EMT 的表型发生逆转，E-cadherin 蛋白表达水平升高及Vimentin 和N-cadherin 蛋白表达水平降低均表现出明显的浓度依赖性，上述结果表明Notch1 信号通路可能是诱导肺腺癌细胞发生EMT 过程的重要途径之一。

顺铂是临床治疗卵巢癌和肺癌等恶性肿瘤常用的一线化疗药物，肿瘤细胞对其产生的多药耐药（multidrug resistance，MDR）影响其疗效［22］。研究［23-24］显示：Notch1 信号通路参与卵巢癌和乳腺癌细胞对顺铂的化疗抵抗作用，但其是否参与肺腺癌细胞对顺铂的耐药作用尚不明确。本研究结果显示：顺铂作用A549 细胞后，随着DAPT 浓度的增加，细胞抑制率也明显升高，表明阻断Notch1 信号通路可增加顺铂的敏感性；顺铂作用A549 细胞后Notch1 和Hes1 的表达均明显上调，表明肺腺癌细胞对顺铂的耐药作用可能与Notch1 信号通路的异常活化密切相关。肿瘤细胞产生MDR 与耐药蛋白的表达有密切关联，本研究结果显示：顺铂作用A549 细胞后P-gp 和MRP1 表达水平明显升高，而与DAPT 联合作用可明显抑制顺铂诱导的P-gp 和MRP1 表达上调，表明Notch1 信号通路可能是顺铂耐药的重要途径之一。

综上所述，Notch1 信号通路可通过诱导MMP-9 和VEGF 蛋白表达及EMT 发生促进肺腺癌细胞的侵袭，并可通过上调P-gp 和MRP1 表达参与肺腺癌细胞对顺铂的耐药作用。本研究结果可为Notch1 信号通路成为阻断肺腺癌侵袭和逆转耐药的治疗靶点提供理论依据。