电损毁外侧缰核对帕金森病模型大鼠空间学习记忆功能的影响及其机制

韩玲娜 ,王春雷 ,常永丽 ,原 丽 ,刘小静

（1.长治医学院生理学教研室，山西 长治 046000；2.长治医学院生物医学工程系，山西 长治 046000；3.西安交通大学第一附属医院感染科，陕西 西安 710061）

帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是一种由黑质纹状体多巴胺（dopamine，DA）通路退化引起的以运动功能障碍为主要症状的神经退行性疾病。然而，PD 常并发多种非运动症状，其中神经精神症状和认知功能障碍，因其严重影响患者生活质量，受到广泛关注［1］。PD 患者可表现出多种认知功能障碍，如执行功能、学习记忆障碍和痴呆等［2］，但其神经机制目前尚不清楚。6-羟多巴胺（6-hydroxydopamine，6-OHDA）神经毒性损伤DA 能神经元制备的PD 大鼠模型已经得到公认，并且广泛应用于PD 的实验研究中。然而，6-OHDA 毒性所致PD 模型大鼠是否存在认知功能障碍目前结论尚不一致［3-5］。外侧缰核（lateral habenular nucleus，LHb）是上丘脑的重要组成部分，是边缘系统和中脑之间的重要驿站，在抑郁、焦虑、应激、镇痛、睡眠和认知功能等多方面发挥重要的调节作用。近年来，关于LHb 与学习记忆关系的研究逐渐增多［6-9］。脑中5-羟色胺（serotonin，5-HT）与学习记忆等高级认知功能密切相关，5-HT 通过调节乙酰胆碱、谷氨酸、γ-氨基丁酸和DA 等神经递质直接或间接影响认知功能。然而，LHb 在PD 认知功能障碍中如何发挥作用，以及是否影响脑中5-HT 水平等问题尚不清楚。因此，本研究采用Morris 水迷宫行为学实验探讨6-OHDA 损毁黑质纹状体通路对大鼠空间学习记忆功能的影响，以及电损毁LHb 对6-OHDA 所致PD 模型大鼠空间学习记忆功能损害的作用；采用神经化学检测PD 模型大鼠和电损毁LHb 后PD模型大鼠脑内内侧前额叶皮层（medial prefrontal cortex，mPFC）和海马中5-HT 水平，旨在阐明LHb 在PD 认知功能障碍中的作用及其相关机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物、主要试剂和仪器

30 只成年雄性SD 大鼠，体质量220～250 g，由西安交通大学实验动物中心提供，动物生产许可证号：SCXK（陕）2012-003，在标准环境下饲养；实验严格执行西安交通大学实验动物使用相关规定；大鼠随机分为3 组：对照组、PD 组和PD+LHb 损毁组（每组10 只）。地昔帕明、阿扑吗啡（apomorphine，APO）和6-OHDA 均为美国Sigma公司产品；地昔帕明溶解于生理盐水，6-OHDA 和APO 均溶解于含0.02%抗坏血酸的生理盐水中。SN-2N 动物脑立体定位仪购于日本Narishige 公司，Ethovision 3.0 行为学信号分析系统软件购于荷兰Noldus Information Technologu 公司。

1.2 6-OHDA 损毁内侧前脑束（medial forebrain bundle，MFB）建立PD 大鼠模型

大鼠经水合氯醛（400 mg·kg－1，腹腔注射）麻醉后，固定于脑立体定位仪上。术前30 min 注射地昔帕明（25 mg·kg－1，腹腔注射）保护去甲肾上腺素能神经元。根据大鼠脑立体定位图谱确定右侧MFB（AP：－4.4mm；L：1.2mm；D：7.8mm），将自制脑内核团局部给药微量注射器插入右侧MFB，以缓慢速度将6-OHDA（12 μg/4 μL）注射至右侧MFB。术后1周给予大鼠APO（0.05 mg·kg－1，颈部皮下注射）检测模型，观察15 min 内大鼠向健侧（左侧）旋转行为，大于20 圈/5 min 视为造模成功［10］，用于下一步实验。本实验中所有PD 组大鼠注射APO 后，15 min 内向左侧旋转圈数均大于24 圈/5 min。对照组大鼠采用同样方法向右侧MFB 注射等量含0.02%抗坏血酸的生理盐水。

1.3 电损毁LHb

6-OHDA 损毁MFB 2 周后，将刺激电极定位于右侧LHb（AP：－3.7 mm，L：0.7 mm，D：4.5 mm），用0.5 mA 的直流电刺激PD 组大鼠LHb，刺激10 s 以达到损毁目的［11］。术后大鼠恢复1 周进行下一步实验。

1.4 大鼠行为学检测

于MFB 损毁后第4 周检测大鼠行为学，即LHb 电损毁1 周后进行，实验在安静环境中进行。

1.4.1 旷场实验检测大鼠自发运动能力 旷场实验用于评价6-OHDA 损毁MFB 和电损毁LHb 对大鼠自发运动能力的影响。旷场箱尺寸为100 cm（长）×100 cm（宽）×40 cm（高），箱底部分为25 个20 cm×20 cm 的方格，旷场箱上方固定摄像头。实验时将大鼠放置于旷场的中心，并记录5 min 内大鼠穿行格数（number of crossed squares）及用后肢站立的次数（number of rearings），大鼠整个身体均爬过方格方可纳入统计，分别检测大鼠的水平运动能力和垂直运动能力。

1.4.2 Morris 水迷宫实验检测大鼠空间学习记忆能力 Morris 水迷宫实验用于检测6-OHDA 损毁MFB 和电损毁LHb 对大鼠空间学习记忆能力的影响。水迷宫由一个直径为15 cm、高50 cm 的宫体和一个水下平台组成，宫体内表面和平台涂成黑色。检测时，宫体内注入水，水温保持为25 ℃±2 ℃，水下平台放置于第一象限中心水下1 cm 处。迷宫上方固定有摄像头，用于采集大鼠在迷宫内的活动轨迹，采集的信号通过行为学信号分析系统软件进行处理。

Morris 水迷宫实验分为定位航行实验和空间探索实验两部分。前5 d 进行定位航行实验，每次将大鼠随机从一个象限面向池壁放入水中，找到平台后让其在平台上停留10 s，记录其找到水下平台时游泳的距离，如果在2 min 内未找到平台，则引导大鼠至平台。每天训练4 次，每次间隔30 s。第6 天进行空间探索实验，将平台撤去，将大鼠放入水中让其自由游泳，记录大鼠在目标象限（第一象限）中游泳距离占总游泳距离的百分率。在定位航行实验中大鼠寻找水下平台游泳距离用于检测大鼠的空间学习功能，在空间探索实验中大鼠在目标象限内游泳距离百分率用于检测大鼠的记忆能力。

1.5 神经化学法检测各组大鼠脑组织中5-HT水平

采用高效液相色谱-电化学检测法检测3 组大鼠脑内mPFC 和海马组织中5-HT 水平。Morris 水迷宫实验后，将大鼠迅速断头取脑，在平台上分离右侧mPFC 和海马，称取质量，按1 mL 0.3 N 高氯酸/4 mg 组织的比例向组织中加入相应体积的高氯酸，组织匀浆后4 ℃低温离心（15 000 r·min－1，15 min），按照1∶2 的比例将上清液与流动相混合，吸取20 μL 样品放入自动进样器中，通过分析柱将5-HT 分离，再经电化学检测器定量分析，通过标准品溶液建立的标注曲线来确定线性方程，根据出峰时间确定5-HT，通过线性方程计算每克组织中5-HT 水平（ng·g－1）。

1.6 免疫组织化学和组织学染色检测大鼠脑组织中DA 能神经元的缺失程度和LHb 损毁情况

神经化学法检测大鼠脑组织中mPFC 和海马组织后，收集剩余脑组织并置于4%多聚甲醛溶液，2 d 后冰冻冠状切片，厚度25 μm，用于酪氨酸羟化酶（tyrosinehydroxylase，TH）免疫组织化学染色，确认6-OHDA 损毁后DA 能神经元丢失程度，验证造模是否成功。TH 染色后DA 能神经元的计数，核圆，核与胞浆完整的细胞被计数，采用每只大鼠选取3 张切片进行计数，最后计算其平均值。尼氏染色，观察LHb 电损毁情况。2 种具体方法如文献［10］所述。

1.7 统计学分析

采用SPSS 18.0 统计软件进行统计学分析。旷场实验中大鼠穿行格数和站立次数，Morris 水迷宫实验中大鼠寻找水下平台游泳距离和目标象限内游泳距离百分比，大鼠脑内mPFC 和海马组织中5-HT 水平，DA 能神经元数目，均符合正态分布，以表示，其中大鼠寻找水下平台游泳距离比较采用多重重复测量，大鼠穿行格数、站立次数、目标象限游泳距离百分比以及5-HT 水平比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验，损毁侧和未损毁侧DA 能神经元数目比较采用配对t检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 旷场实验检测各组大鼠自发运动能力

与对照组比较，PD 组大鼠的穿行格数和站立次数均明显减少（P＜0.01）；与PD 组比较，PD+LHb 损毁组大鼠的穿行格数和站立次数差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 3 组大鼠自发运动能力Tab.1 Locomotor activities of rats in three groups(n=10，）

表1 3 组大鼠自发运动能力Tab.1 Locomotor activities of rats in three groups(n=10，）

*P＜0.01 vs control group.

2.2 Morris 水迷宫实验检测各组大鼠空间学习记忆功能

在定位航行实验中，随着训练天数的增加，对照组和PD 组大鼠寻找水下平台游泳距离均逐渐减少。除训练第1 天外，与对照组比较，PD 组大鼠寻找水下平台游泳距离在第2～5 天均明显增加（第2 天，P＜0.01；第3 天，P＜0.01；第4 天，P＜0.01；第5 天，P＜0.01）。空间探索实验中，与对照组比较，PD 组大鼠在目标象限内游泳距离占总距离的百分率明显降低（P＜0.05）。见表2。图1A 和1B 为对照组和PD 组大鼠在定位航行实验第4 天的游泳原始轨迹图。

2.3 Morris 水迷宫实验检测电损毁LHb 后PD 模型大鼠空间学习记忆功能

在定位航行实验中，随着训练天数的增加，PD+LHb 损毁组大鼠寻找水下平台的游泳距离均逐渐减少。除训练第1 天外，与PD 组比较，PD+LHb 损毁组大鼠的游泳距离在第2～5 天均明显增加（第2 天，P＜0.01；第3 天，P＜0.01；第4 天，P＜0.01；第5 天，P＜0.01）。在空间探索实验中，与PD 组比较，PD+LHb 损毁组大鼠在目标象限内的游泳距离占总距离的百分率明显降低（P＜0.05）。见表2。图1C 为PD 组和PD+LHb 损毁组大鼠在定位航行实验第4 天的游泳原始轨迹图。

图1 定位航行实验第4 天3 组大鼠典型游泳原始轨迹图Fig.1 Typical swimming tracks of rats in navigation experiment on 4th day in three groups

表2 3 组大鼠寻找水下平台游泳距离和目标象限内游泳距离百分率Tab.2 Distances to find hidden platform and percentages of swimming distance in target quadrant of rats in three groups(n=10，）

表2 3 组大鼠寻找水下平台游泳距离和目标象限内游泳距离百分率Tab.2 Distances to find hidden platform and percentages of swimming distance in target quadrant of rats in three groups(n=10，）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs PD group.

2.4 各组大鼠脑组织中5-HT 水平

与对照组比较，PD 组大鼠脑内mPFC 和海马组织中5-HT 水平有降低趋势，但差异均无统计学意义（P＞0.05），提示PD模型大鼠出现学习记忆功能损伤与mPFC 和海马组织中5-HT 水平变化无关。

与PD 组比较，PD+LHb 损毁组大鼠mPFC 和海马且组织中5-HT 水平均明显降低（mPFC：P＜0.01；海马组织：P＜0.01），提示LHb 损毁对PD模型大鼠学习记忆功能的进一步损伤与其引起mPFC和海马组织中5-HT 水平下降有关。见表3。

表3 3 组大鼠mPFC 和海马组织中5-HT 水平Tab.3 Levels of 5-HT in mPFC and hippocampus tissues of rats in three groups [n=10,,wB/(ng·g－1)]

表3 3 组大鼠mPFC 和海马组织中5-HT 水平Tab.3 Levels of 5-HT in mPFC and hippocampus tissues of rats in three groups [n=10,,wB/(ng·g－1)]

*P＜0.01 vs PD group.

2.5 免疫组织化学和组织学染色检测大鼠脑组织中DA 能神经元缺失程度和LHb 电损毁程度

图2A 和2B 为对照组和PD 组大鼠黑质致密部（substantia nigrapars compacta，SNc）和腹侧被盖区（ventral tegmental area，VTA）TH 免疫组织化学染色图：对照组大鼠双侧SNc 和VTA 中的DA能神经元数目无明显变化（图2A）；PD 组大鼠损毁侧（右侧）SNc 中DA 能神经元完全缺失，且损毁侧VTA 中DA 能神经元明显减少，仅为未损毁侧的（59±17）%（t=6.540，P＜0.01；图2B）。图2C 为PD+LHb 损毁组大鼠的LHb 尼氏染色图，可见右侧LHb 被部分损毁。

图2 对照组（A）和PD 组（B）大鼠TH 免疫组织化学染色结果及LHb 损毁组尼氏染色结果（C）（Bar=400 μm）Fig.2 Results of TH immunohistochemical staining of rats in control(A)and PD(B)groups and result of Nissl’s staining of rats in LHb lesion group(C)（Bar=400 μm）

3 讨论

本研究结果显示：6-OHDA 单侧损毁MFB 后，PD 大鼠的运动能力明显下降，但与PD 组比较，电损毁LHb 后，大鼠的运动能力无明显变化，表明本研究中单侧电损毁LHb 对PD 大鼠在Morris 水迷宫实验中的行为改变，与其运动能力无直接关系，排除了运动能力对行为学实验结果的影响。

认知功能障碍是PD 常见的非运动症状之一，其中学习记忆功能损伤是PD 认知功能障碍的常见表现，可出现在PD 的早期或晚期［12］。本研究Morris 水迷宫实验中，与对照组比较，6-OHDA 损毁MFB 后，PD 组大鼠在第2～5 天寻找水下平台游泳的距离明显增加，第6 天目标象限内游泳距离百分率明显降低，即PD 大鼠出现空间学习记忆功能损伤。前期相关研究［3，5，13-17］采用不同的行为学方法也得到了相同的结果：PD 大鼠在不同的记忆任务中出现记忆障碍。还有2 项研究［4，18］显示：6-OHDA 损毁大鼠无认知行为改变。出现不同结果的原因可能与6-OHDA 注射位点、损毁程度、单双侧损毁以及行为学检测方法及时间点等多种因素有关。研究［19-20］表明：DA 和5-HT 递质系统在对包括学习记忆在内的认知功能调节作用发挥重要作用。已有研究［21-23］证实：6-OHDA 单侧损毁MFB后，大鼠脑内DA 水平降低，但5-HT 水平不变；本研究结果也显示：PD 大鼠脑内mPFC 和海马组织中5-HT 水平未发生明显变化。上述结果表明：黑质纹状体通路损毁后脑内DA 水平下降是导致PD 大鼠出现学习记忆能力下降的原因之一。

LHb 与大鼠学习记忆之间关系密切［6-8］，LHb与海马组织间虽无直接的纤维联系，但电刺激LHb可以通过中缝中核的5-HT 能神经纤维间接影响海马锥体神经元的活动［24］，从而改变海马的Theta 节律，最终发挥对认知功能的调节作用。研究［9］表明：衰老性记忆减退大鼠的LHb 代谢活动明显降低，损毁LHb 可导致大鼠在水迷宫中的空间记忆能力下降，损毁LHb 与损毁背侧海马后引起的记忆能力下降的行为学表现是完全一致的，提示LHb可能参与记忆形成过程中海马网络的整合。5-HT与包括学习记忆在内的认知功能密切相关，海马组织中5-HT 水平的变化可改变机体的学习记忆能力，5-HT 水平降低可诱发学习和记忆功能障碍，而其水平升高则有促进学习和记忆能力的作用［25-27］。LHb 发出神经纤维投射至中缝核，通过影响5-HT 能神经元的活动而改变脑中5-HT 递质的释放。关于LHb 对PD 大鼠认知功能障碍以及对PD 大鼠5-HT 作用的研究目前尚无报道。本研究Morris 水迷宫实验结果显示：与PD 组比较，PD+LHb 损毁组大鼠在第2～5 天寻找水下平台的游泳距离明显增加，第6 天目标象限内游泳距离百分率明显下降，提示损毁LHb 加重PD 大鼠空间学习记忆功能的损伤；神经化学检测结果显示：PD+LHb 损毁组大鼠脑内mPFC 和海马组织中5-HT 水平均较PD 组明显降低。上述结果表明：LHb 对PD 大鼠空间学习记忆功能的调节作用与其调节中脑5-HT 能神经元活性和脑区中5-HT 水平有密切关联。

本研究结果显示：MFB 单侧损毁所致PD 模型大鼠具有空间学习记忆功能的损伤，损毁LHb 可加重PD 模型大鼠空间学习记忆功能的损伤。基于以往的研究和目前研究结果，本文作者认为：6-OHDA 单侧损毁MFB 导致的PD 模型大鼠空间学习记忆功能损伤与脑内DA 水平降低有关，而损毁LHb 加重PD 大鼠空间学习记忆损伤与其导致脑内5-HT 水平降低有关。