没食子酸对M1 型巨噬细胞极化的影响

毛赫新 ,王琳源 ,关 宁 ,高秀秋

（1.锦州医科大学附属第二医院牙周黏膜科，辽宁 锦州 121000；2.锦州医科大学附属第一医院脑与脊髓损伤重点实验室，辽宁 锦州 121000）

巨噬细胞作为固有免疫应答的重要组成部分，在宿主免疫中占有重要地位，其功能主要表现在识别、吞噬和清除外来病原体及异物等［1］。巨噬细胞具有可塑性，在不同微环境下可分化为不同细胞亚型。巨噬细胞在白细胞介素2（interleukin-2，IL-2）和干扰素γ（interferon-γ，IFN-γ）的作用下可分化为M1 型巨噬细胞，产生高水平的诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）和信号转导与转录激活因子1（signal transducerand activator of transcription 1，STAT1）［2-3］，分泌大量肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素1（interleukin-1，IL-1）和白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）等炎性细胞因子，并产生大量活性氧（reactive oxygen species，ROS）和活性氮（reactive nitrogen species，RNS）参与病毒性心肌炎、骨关节炎和感染性肠胃炎等炎症性疾病的发病过程［4-5］。没食子酸（gallic acid，GA）是一类天然的多酚类化合物，其化学名为3，4，5-三羟基苯甲酸，GA 在抑菌、抗炎、防过敏、抗肿瘤和抵御氧化等方面具有良好的治疗效果，在免疫细胞分化、活化和维持免疫系统的稳定过程中也发挥着多种功能［6-8］。近年来，研究［9-10］表明：GA 可通过影响巨噬细胞相关因子的表达而发挥抗炎作用，然而有关GA 对巨噬细胞极化的研究尚未见相关文献报道。本实验通过在体外建立M1 型巨噬细胞极化模型，利用GA 干预M1 型巨噬细胞极化过程，明确GA 对M1 型巨噬细胞极化的影响，为以M1 型巨噬细胞为靶向的免疫调控提供新的实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物、主要试剂和仪器8 周龄、体质量约20 g 的SPF 级C57BL/6 小鼠，购自辽宁长生生物技术有限公司，动物使用许可证号：SYXK（辽）2019-0007。正常膳食喂养，光照周期为12 h∶12 h，按照《实验动物许可管理办法》和《实验动物管理条例》 的相关规定进行实验。GA 购自美国TargetMol 公 司，RPMI 1640 培养基和胎牛血清购自美国Invitrogen 公司，F4/80 抗体和iNOS 抗体购自美国Cell Signaling 公司，Annexin Ⅴ-PE/7-AAD 细胞凋亡检测试剂盒和反转录试剂盒购自中国Vazyme 公司，TRIzol 购自美国Ambion 公司，iNOS、β-actin 和IL-1β 引物购自北京鼎国昌盛生物有限公司。流式细胞仪购自美国BD 公司，实体显微镜购自日本Olympus 公司，实时荧光定量 PCR（Real-time fluorescence quatitative PCR，RT-qPCR）仪和高速低温离心机购自美国Thermo 公司，涡旋混合器购自江苏省其林贝尔仪器制造厂，电子天平购自北京市赛多利斯天平有限公司，迷你离心机购自北京昊诺斯生物公司，微量加样器购自法国吉尔森公司。

1.2 小鼠腹腔巨噬细胞的提取取8 周龄C57BL/6 雌性小鼠，灌洗腹腔收集腹腔液，收集细胞沉淀并重悬，台盼蓝拒染法计数活细胞大于95%，采用RPMI 1640 完全培养基（含10% 胎牛血清和1% 青霉素-链霉素）调整细胞浓度，以每孔3.5×105个细胞数接种于96 孔细胞培养板中，置于细胞培养箱中培养2 h 后，差速贴壁法去除未贴壁细胞，收集得到贴壁的小鼠腹腔巨噬细胞［11］。

1.3 实验分组和处理方法将原代培养腹腔巨噬细胞随机分为对照组、M1 极化模型组和GA 组，每组设置3 个复孔。对照组中加入等体积的培养液；M1 极化模 型组用 100 μg·L－1脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）和20 μg·L－1IFN-γ 共同刺激细胞24 h 诱导腹腔巨噬细胞向M1 型极化；GA 组用37.5 mg·L－1GA 与LPS 和IFN-γ 共同处理腹腔巨噬细胞24 h。

1.4 倒置显微镜观察各组细胞形态表现细胞分组同上，细胞培养24 h 后，倒置显微镜（×400）观察各组细胞形态表现。

1.5 AnnexinⅤ-PE/7-AAD 双染法检测各组细胞凋亡率严格按照说明书操作将各组细胞样本制成浓度为1×106mL－1单细胞悬液，吸取100 μL 重悬液到流式管中，加入5 μL Annexin Ⅴ-PE 和5 μ L 7-AAD Staining Solution，吹匀，避光、室温孵育10 min，加 入400 μ L 1× Binding Buffer，混 匀，1 h 内用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率，采用FlowJo 7.6.1 软件进行数据分析，计算细胞凋亡率。细胞凋亡率=（早期凋亡细胞数+晚期凋亡细胞数）/细胞总数×100%，实验重复3 次。

1.6 流式细胞术检测M1 型巨噬细胞阳性表达率将各组细胞悬液分别以每管1×106个细胞加入流式管并根据组别进行编号。用FITC 标记的F4/80 抗体以及相应的同型对照抗体进行胞外因子染色，用PE 标记的iNOS 抗体以及相应的同型对照抗体进行胞内因子染色，350 μL Staining Buffer 洗涤重悬，立即上机检测。以前向散射角和侧向散射角确定巨噬细胞群，采用 FlowJo 7.6.1 软件分析F4/80+iNOS+M1 型巨噬细胞占比，即阳性表达率，实验重复3 次。

1.7 RT-qPCR 法检测各组细胞中iNOS 和IL-1β mRNA 表达提取细胞的总RNA 反转录合成cDNA，扩增。按照试剂盒的步骤进行实验操作。每孔依次加入2 μ L cDNA、10 μL 2×mix、3'和5'端引物各0.4 μL，无菌水7.2 μL。ABI7900 型PCR 仪进行反应，每组3 个平行样品。引物序列：iNOS，上游引物5'-GGGTCACAACTTTACAGGGAGT-3'，下游引物5'-GAGTGAACAAGACCCAAGCG-3'；IL-1β，上游引物5'-TGCCACCTTTTGACAGTGATG-3'，下游引物 5'-TGTGCTGCGAGATTTGA-3' ；β-actin上游引物5'-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3'，下游引物5'-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3'。引物均由北京鼎国昌盛生物科技有限公司合成。反应条件：预变性95 ℃、30 s；循环反应95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，共40 个循环；熔解曲线95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，95 ℃、15 s。以β-actin为内参，采 用2－ΔΔCt值表示目的基因mRNA 相对表达水平。目的基因相对表达量的ΔCt=实验组或对照组目的基因Ctβ-actin Ct，ΔΔCt=实验组ΔCt－对照组ΔCt。

1.8 统计学分析采用SPSS 23.0 统计软件进行统计学分析。各组中细胞凋亡率，M1 型巨噬细胞阳性表达率，iNOS 和IL-1β mRNA 表达水平均符合正态分布，以表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞形态表现体外培养24 h 后，对照组可见细胞呈圆形或椭圆形；M1 极化模型组可见细胞主要表现为梭形，并且有伪足伸出；与M1 极化模型组比较，GA 组可见梭形细胞减少，圆形细胞增多，且伸出伪足减少。见图1。

图1 各组细胞形态表现（×400）Fig.1 Morphology of cells in various groups（×400）

2.2 各组细胞凋亡率流式细胞术检测各组细胞凋亡率，对照组、M1 极化模型组和GA 组细胞凋亡率分别为（10.14±0.74）%、（10.29±0.62）%和（10.34±0.86）%，3 组间巨噬细胞凋亡率比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见图2。

图2 各组巨噬细胞凋亡率Fig.2 Apoptotic rates of macrophages in various groups

2.3 各组M1 型巨噬细胞阳性表达率对照组、M1 极化模型组和GA 组F4/80+iNOS+M1 型巨噬细胞阳性表达率分别 为（6.94±1.21）%、（89.2±1.38）%和（7.54±0.96）%，与对照组比较，M1 极化模型组F4/80+iNOS+M1 型巨噬细胞阳性表达率升高（P＜0.01），GA 组F4/80+iNOS+M1 型巨噬细胞阳性表达率升高，但差异无统计学意义（P＞0.05）；与M1 极化模型组比较，GA 组F4/80+iNOS+M1 型巨噬细胞阳性表达率明显降低（P＜0.01）。见图3。

图3 各组F4/80+iNOS+M1 型巨噬细胞表达情况Fig.3 Expressions of F4/80+iNOS+M1 macrophages in various groups

2.4 各组细胞中M1 型巨噬细胞相关因子mRNA表达水平与对照组比较，M1 极化模型组细胞中iNOS 和IL-1β mRNA 表达水平明显升高（P＜0.01），GA 组细胞中iNOS 和IL-1β mRNA 表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）；与M1 极化模型组比较，GA 组细胞中iNOS 和IL-1β mRNA 表 达水平明显降低（P＜0.01）。见表1。

表1 各组细胞中iNOS 和IL-1β mRNA 表达水平Tab.1 Expression levels of iNOS and IL-1β mRNA in cells in various groups (n=3，）

表1 各组细胞中iNOS 和IL-1β mRNA 表达水平Tab.1 Expression levels of iNOS and IL-1β mRNA in cells in various groups (n=3，）

*P＜0.01 vs control group；△P＜0.01 vs M1 polarization model group.

3 讨论

巨噬细胞作为机体重要的免疫细胞，具有很强的可塑性，在炎症反应和维持机体稳态过程中发挥重要的作用。M1 型巨噬细胞主要通过分泌iNOS、TNF-α 和IL-1β 等，介导炎症反应的发生［12-13］。LPS 诱导建立炎症模型是建立炎症模型的最常见方法，其机制为LPS 与细胞表面的CD14 结合，再结合TLR4 复合物，激活肿瘤坏死受体相关因子6，进一步激活转化生长因子激活激酶1，使NF-κB 抑制性蛋白（NF-kappa B inhibitor，IκB）激酶磷酸化，导致IκB 降解，使NF-κB 信号通路激活，促进炎症因子释放，同时启动iNOS 转录，释放NO，促进巨噬细胞向M1 型极化［14-15］；IFN-γ 是体内NK细胞分泌的一种物质，其对巨噬细胞具有致敏作用，即该物质不会直接造成巨噬细胞的极化，或影响较小，但其会激发巨噬细胞的炎症潜能，促进巨噬细胞对于LPS 等外界刺激的反应性增强，导致极化反应的增强［16-17］。小鼠腹腔巨噬细胞在医学研究中应用十分普遍，是许多炎症相关研究模型的常用细胞，也有文献［9］报道采用RAW264.7 细胞系进行实验，但有研究［18-19］显示：RAW264.7 细胞系在连续培养的过程会不断发生突变，长时间的多次传代可能会导致细胞系的基因型和表型均发生变化，相比之下，原代细胞保持了细胞在体内的许多重要标志和功能，因此本实验选用提取小鼠腹腔巨噬细胞诱导建立体外M1 型巨噬细胞极化模型。

GA 是多种新型药用植物中较为常见的一种多酚类有机化合物，具有广泛的临床应用价值，可用于抑制肿瘤细胞形成，并诱导其凋亡，在肿瘤形成各阶段中均起到预防和抑制作用［20-21］，在慢性骨关节炎中也可对软骨关节起到一定的保护作用［22］，并可对防治神经退行性疾病具有潜在价值［23］。黄丽华等［9］研究显示：GA 可通过抑制TLR4/NFκB 信号通路的表达而减少TNF-α、IL-6 和IL-1 等RAW264.7 巨噬细胞炎性因子的过度表达，从而有效保护LPS 所致的机体损伤。AHN 等［10］研究显示：GA 能通过67LR 通路下调LPS 刺激的RAW264.7 巨噬细胞TLR4 信号转导作用，抑制丝裂原活化蛋白激酶的激活，进而减少促炎细胞因子的生成。上述结果提示：GA 可通过多种信号通路调控巨噬细胞的功能。巨噬细胞具有可塑性，可在特定微环境作用下极化为M1 型巨噬细胞，后者可通过产生促炎反应因子iNOS、TNF-α、IL-6 和氧自由基等介导炎症反应［24］。目前有关GA 对巨噬细胞的研究，多局限于GA 对巨噬细胞相关因子表达的影响，而有关GA 对巨噬细胞极化的研究尚未开展。本研究以小鼠腹腔巨噬细胞作为研究对象，建立M1 型巨噬细胞极化模型，观察各组细胞中M1 型巨噬细胞占比及其相关炎性细胞因子mRNA表达水平。本研究结果显示：在M1 型巨噬细胞极化过程中，巨噬细胞逐渐由圆形或椭圆形转变为以梭形为主，并且有伪足伸出，而在经过GA 处理后，巨噬细胞的镜下形态又发生了改变，梭形细胞和不规则细胞减少，圆形细胞增多且伸出伪足减少，表明GA 能够影响M1 型巨噬细胞的极化过程。本研究中细胞凋亡率检测结果显示：M1 型巨噬细胞诱导分化体系在加入37.5 mg·L－1GA 后，其细胞凋亡率无明显改变，说明GA 对巨噬细胞的凋亡无明显影响。本研究中M1 型巨噬细胞的细胞表型和相关细胞因子mRNA 表达结果显示：GA 能够有效地减少F4/80+iNOS+M1 型巨噬细胞阳性表达率，下调IL-1β和iNOS mRNA 表达水平。F4/80＋是小鼠腹腔巨噬细胞的表面标志物［25］，而iNOS 和IL-1β 表达水平能够反映M1 型巨噬细胞极化程度［26-27］，本研究结果表明：GA 能够抑制IFN-γ/LPS 诱导的小鼠腹腔巨噬细胞向M1 型的极化。

研究［28-31］显示：巨噬细胞可通过病原体相关分子模式借Toll 样受体4（Toll-like receptors 4，TLR4）或IL-1 信号激活IκB 激酶（IκB kinase，IKK）复合物，通过TLR2/核因子κB（nuclear factor κB，NF-κB）关键炎症信号通路调节巨噬细胞的M1 型活化。而GA 能通过竞争性拮抗作用阻止IκB 降解，进而抑制NF-κB 激活，阻断TLR4/NF-κB 信号通路的表达［32-33］。本文作者推测GA 可能通过阻断TLR4/NF-κB 信号通路表达而抑制M1 型巨噬细胞的极化，这一机制可能是GA 抑制M1 型巨噬细胞极化的原因。

综上所述，37.5 mg·L－1GA 对巨噬细胞凋亡无明显影响，但可抑制巨噬细胞向M1 型极化，提示其可用于M1 型巨噬细胞相关炎症性疾病的治疗。GA 作为一种多酚类有机抗炎药物，可能通过多种机制影响M1 型巨噬细胞极化，其有关机制还有待于进一步的研究。