雷公藤甲素对人骨肉瘤细胞阿霉素耐药株的逆转作用及机制研究

高 峰，王秀会，夏胜利，周小小，易存国，付备刚，沈 超，王明辉

(上海健康医学院附属周浦医院 上海市浦东新区周浦医院，上海 201318)

骨肉瘤是青少年常见的骨恶性肿瘤，多发于10～16岁，具有恶性程度高和预后差的特点。2009年以前骨肉瘤患者的5年生存率仅为45.7%，随着新辅助化疗技术在骨肉瘤治疗中的应用，骨肉瘤患者的生命质量已得到较大提高[1]。新辅助化疗技术治疗骨肉瘤有两个显著弊端：①肿瘤细胞易迅速对化疗药物出现耐药；②多药耐药(Multidrug resistance，MDR)导致化疗药物效能降低[2]。研究[3]指出，P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)会将化疗药物从胞内泵出胞外，导致细胞毒药物浓度降低，单纯提高细胞毒药物浓度来应对MDR效果并不理想。因此，寻找能逆转MDR作用且毒副作用较小的化疗增敏剂对提高骨肉瘤的治疗效果具有重要意义。雷公藤草本具有抗炎、抗肿瘤和调节免疫等药理作用[4]。雷公藤甲素(Triptolide，TPL)是从雷公藤中提取的单体化合物，是雷公藤发挥活性的主要成分之一[5-6]。刘倩等[7]报道TPL可抑制肺小细胞肺癌细胞系A549增殖和诱导凋亡。惠璐璐等[8]证实TPL可提高K562/A02细胞对阿霉素(Adriamycin RD，ADR)的敏感性。因此，本研究探讨TPL体外给药对骨肉瘤细胞MDR效应的逆转作用及其可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 人骨肉瘤细胞株U2OS购自中科院上海细胞研究所；CCK-8试剂盒(批号：20170015)购自南京建成生物科技有限公司；实时定量PCR(qRT-PCR)试剂盒(批号：A1852)、罗丹明-123(Rh123，批号：G1124)购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司；P-gp单抗(批号：557003)购自美国CST公司；磷酸化蛋白激酶B(p-AKT，批号：G1708)、人磷酸化磷酸肌醇3激酶(p-PI3K，批号：G1708)、多药耐药蛋白质1(MDR1)单抗(批号：55510)购自美国Abcam公司；TPL(批号：2017002)和ADR(批号：2017014)购自山东天晟生物科技有限公司；维拉帕米(VER)注射液(批号：国药准字H31021343)购自上海禾丰制药有限公司。

1.2 建立耐药细胞株模型 耐药细胞株U2OS/ADR使用浓度递增法进行诱导：取处于对数生长期U2OS细胞，无菌PBS冲洗后加入含ADR(10 μmol/L)的10%血清RPMI-1640培养液于37 ℃、5% CO2条件下继续培养24 h，吸弃培养液并用胰蛋白酶消化处理成单细胞悬液，计数后调整细胞浓度为2×105/ml并接种于新的培养瓶(不含ADR的新鲜培养液)。待细胞进入对数生长期，无菌PBS冲洗后加入含ADR(20 μmol/L)培养液继续培养24 h。重复上述操作，直至U2OS细胞可在含1000 nmol/L ADR的培养液中生长为止。实验前脱药1周，U2OS和U2OS/ADR细胞均采用含10%血清RPMI-1640培养液于37 ℃、5% CO2条件下进行培养。

1.3 MTT法测定TPL对U2OS/ADR细胞增殖的影响 取处于对数生长期的U2OS和U2OS/ADR细胞消化后，调整密度为5×104/ml，加入96孔板中(100 μl/孔)，于37 ℃、5% CO2条件下培养过夜。耐药指数实验时，加入不同浓度梯度的ADR。逆转倍数实验时，设置ADR浓度分别为10、20、40、80、160、320 μmol/L，实验组加入TPL(10 μmol/L)，阳性对照组加入VER(10 μmol/L)。继续培养48 h后，于每孔中加入CCK-8工作液10 μl，混匀后避光孵育30 min，在490 nm处用酶标仪读取吸光值。逆转倍数=(U2OS/ADR IC50)/(加逆转剂后U2OS/ADR IC50)。耐药指数=(U2OS/ADR IC50)/U2OS IC50。

1.4 流式细胞术检测U2OS/ADR细胞内Rh123评估P-gp水平 取对数生长期U2OS和U2OS/ADR细胞，每孔中加入TPL(10 μmol/L)，继续于37 ℃、5% CO2条件下培养24 h，然后加入10 μmol/L Rh123染液，1 h后消化收集细胞，用流式细胞仪检测细胞荧光信号强度(488 nm激发光，560 nm发射光)。Rh123阳性细胞数与P-gp转运作用呈负相关。

1.5 Western blot检测U2OS/ADR细胞中p-PI3K、p-AKT、MDR1和肺耐药相关蛋白(LRP)表达水平 采用 BCA蛋白定量法对样本总蛋白浓度定量后在样本中加入适量上样缓冲液并吹打均匀，然后放入沸水中10 min，使蛋白发生变性，置于冰箱-20 ℃保存备用。制备聚丙烯凝胶，将每孔10 μl样品电泳分离1.5 h后转膜2 h，脱脂奶粉封闭2 h。取出封闭的膜，TPBS冲洗3次，然后用PBS冲洗1次；p-PI3K、p-AKT、MDR1、LRP一抗(1∶500)常温孵育12 h，TPBS冲洗3次，二抗(1∶50000)孵育30 min，TPBS冲洗3次，PBS冲洗1次。洗膜时间均为10 min/次。配置适量显影液后均匀加于条带上，凝胶成像系统扫描后使用Image-Pro Plus软件进行分析。

1.6 qRT-PCR检测U2OS/ADR细胞中MDR1基因mRNA表达水平 取处于对数生长期的U2OS和U2OS/ADR细胞，每孔中加入TPL(10 μmol/L)，37 ℃、5% CO2条件下继续培养24 h，而后消化并收集细胞。TRIzol法提取样本总RNA以后逆转录得到cDNA。MDR1上游引物序列为5’-AAAAAGATCAACTCGTACCACTC-3’，下游引物序列为5’-GCACA AAATACACCAACAA-3’。94 ℃变性3 min后，按下述条件扩增40个循环：95 ℃ 5 s，65 ℃ 35 s，72 ℃ 60 s。扩增后72 ℃延伸5 min。

2 结 果

2.1 TPL对U2OS/ADR细胞增殖的影响 CCK-8实验显示，TPL浓度为10 μmol/L时，U2OS/ADR细胞的生长速率有所限制，抑制率为(14.9±1.44)%，未超过15%，依然属于低增殖毒性浓度，故后续研究使用的TPL浓度为10 μmol/L。

2.2 TPL对U2OS/ADR细胞对ADR敏感性的影响 见图1。与对照组相比，TPL组使ADR对U2OS/ADR细胞生长的抑制作用提高(F=177.5,P<0.05)。ADR对U2OS、U2OS/ADR、TPL+U2OS/ADR、VER+U2OS抑制作用的IC50分别为(40.7±2.17)、(63.4±4.14)、(38.6±3.35)和(47.5±3.13)μmol/L(均P<0.05)。使用前述公式计算，耐药指数和逆转倍数分别为1.56和1.64，提示TPL具有逆转U2OS/ADR细胞MDR的作用。

图1 TPL对U2OS/ADR细胞对ADR敏感性的影响

2.3 TPL对Rh123阳性U2OS/ADR细胞计数的影响 见图2。TPL组Rh123阳性信号计数与对照组相比提高(F=61.3，P<0.001)，相对比为2.12±0.17，提示TPL处理可抑制细胞膜P-gp对Rh123的外排作用。

注：与对照组相比，***P<0.001。空白组：U2OS；

2.4 TPL对U2OS/ADR细胞p-PI3K、p-AKT、MDR1和LRP蛋白表达的影响 见图3。Western blot结果显示，经TPL处理后的U2OS/ADR细胞p-PI3K、p-AKT、MDR1和LRP蛋白表达水平与对照组相比均降低(均P<0.05)。

注：与对照组相比，*P<0.05，***P<0.001。空白组：U2OS；对照组：U2OS/ADR；TPL组：U2OS/ADR+TPL10 μmol/L；VER组：U2OS/ADR+VER 10 μmol/L

2.5 TPL对U2OS/ADR细胞MDR1基因mRNA水平的影响 见图4。经TPL作用后，对照组细胞MDR1基因mRNA水平有所下降(F=72.0，P<0.001)；TPL组MDR1基因mRNA荧光强度为对照组的(21.3±1.07)%，组间比较具有统计学差异(t=13.342，P<0.001)。

注：与对照组相比，***P<0.001。空白组：U2OS；

3 讨 论

骨肉瘤化疗耐药的发生是一个涉及多因素、多水平、多基因的复杂过程，其发生机制主要与膜转运蛋白、肿瘤干细胞、细胞内解毒系统、细胞凋亡等有关[9]。1976年，Juliano等首次发现肿瘤细胞耐药的重要机制——跨膜转运蛋白的药泵作用，上述机制被称为“经典的MDR”。ABC转运蛋白是药泵作用中最重要的泵蛋白，包括P-gp和多药耐药相关蛋白(MRP)等[10]。当这些蛋白质与药物结合时，会使蛋白质构象发生改变，导致细胞内药物排出到胞外，从而引起细胞内药物的有效浓度下降，产生肿瘤细胞耐药[11]。贵鹏等[12]发现MDR1和P-gp是引起骨肉瘤细胞对化疗药物不敏感的机制之一。Celia等[13]报道MDR1的表达水平与骨肉瘤细胞对化疗药物的敏感性密切相关，MDR1水平越高，细胞对药物敏的感性越低。本研究结果显示，与U2OS组细胞相比，U2OS/ADR组细胞中MDR1和P-gp水平明显升高，说明MDR1和P-gp的过度表达是骨肉瘤细胞MDR的重要机制。因此，抵抗上述骨肉瘤细胞MDR机制的最直接方法是逆转由P-gp介导的MDR，潜在的干预方案主要有3种，包括抑制MDR1 基因的表达、抑制P-gp 活性以及抑制ATP 酶[14]。研究[15]表明，中药单体对于逆转介导的MDR具有毒性低、疗效显著的特点，成为研究的热点。苦参碱可通过下调耐药细胞T24/ADM中MDR1表达P-gp 逆转细胞的耐药性[16]。Marsousi等[17]研究发现，姜黄素处理结直肠癌细胞Caco-2可显著下调细胞P-gp mRNA表达水平，减少细胞内罗丹明123外排效率。刘风玲等[18]发现粉防己碱能下调耐药细胞SKOV3/DDP中MDR1 mRNA 表达，部分逆转细胞的耐药性。TPL是一个具有多重生物活性的天然产物，具有抗类风湿、抗氧化和抗癌等功效[5]。前期研究[19-20]也表明，TPL有提高A549/DDP、K562/A02等细胞药物敏感性的作用。但其作用机制尚不明确，对骨肉瘤细胞耐药的作用尚未见报道。

本研究证实，TPL可以剂量依赖的方式抑制U2OS/ADR细胞增殖，TPL处理后U2OS细胞对ADR的敏感性提高。流式细胞仪检测结果显示U2OS/ADR细胞内Rh123下降，细胞膜表面P-gp表达水平上升，证实本研究采用的细胞模型U2OS抵抗ADR作用与肿瘤药物外排相关蛋白的表达上调有关。经TPL处理后，U2OS/ADR细胞内Rh123水平升高，膜表面P-gp信号下降，证实TPL具有逆转MDR现象的作用。Western blot和qRT-PCR结果表明，TPL处理后U2OS/ADR细胞MDR1、LRP、p-PI3K和p-AKT水平下降，证实TPL可以影响PI3K/AKT信号通路，抑制与MDR现象密切相关的蛋白表达。

综上所述，TPL具有抑制U2OS/ADR细胞生长、提高U2OS对ADR敏感性的作用，其机制可能与抑制PI3K/AKT信号通路活化、下调U2OS/ADR细胞MDR1和LRP基因表达、抑制P-gp对细胞毒物质的外排有关。