雷公藤甲素对脂多糖诱导脊髓损伤小鼠及BV2小胶质细胞的调节作用及机制研究

闫 真，王雅玲，高 枫

(延安大学医学院，陕西 延安 716000)

脊髓损伤(Spinal cord injury，SCI)是世界范围内的一个公共卫生问题，神经炎症在SCI继发性损伤中起关键作用[1-3]。小胶质细胞是中枢神经系统的主要先天免疫细胞，在神经炎症中发挥着重要作用。小胶质细胞在脊髓损伤反应中被迅速激活，导致多种信号级联介导的促炎细胞因子上调。而过度的小胶质细胞激活可导致促炎因子如白细胞介素(IL)-1β、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和活性氧(ROS)过量产生，从而加重炎症反应及继发性损伤[3-7]。

雷公藤甲素(Triptolide，TPL)是一种天然生物活性化合物，最早从中药雷公藤根中提取分离得到，是雷公藤的主要生物活性成分。TPL具有抗风湿、抗菌、抗炎、免疫调节和抗肿瘤药理作用，因其对多种疾病的疗效而引起研究者广泛关注，但其临床潜力仍有待充分发掘[8-10]。目前，细胞移植已成为SCI一种有效治疗选择，其原理侧重于减弱小胶质细胞的激活，抑制相关细胞因子的产生，以减少炎症和SCI[11-13]。我们认为调节由过度活跃的小胶质细胞引起的炎症障碍可能是一种有前景的SCI治疗方法，因此本研究以脂多糖(LPS)刺激的BV2小胶质细胞和SCI小鼠模型为对象，探讨TPL对SCI的影响及可能分子机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与细胞株 C57小鼠45只，6周龄，体重为100～120 g，购自上海模式生物科技股份有限公司，合格证号：SCXK(沪)2016-0008；常规饲养，给予食物与水分，温度为20～24 ℃，空气相对湿度为50%，正常昼夜更替(12 h光照/12 h黑暗)。BV2细胞系购自中国科学院上海生化研究所。

1.2 主要试剂 DMEM培养基；胎牛血清(FBS)；青链霉素(15140-122，Gibco)；二甲基亚砜(DMSO)；TPL(645900，Sigma)；LPS(L4391，Sigma)；小鼠TNF-α 酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒(E-EL-M0049c，伊莱瑞特)；小鼠IL-6 ELISA 试剂盒(E-EL-M0044c，伊莱瑞特)；小鼠IL-1β ELISA试剂盒(E-EL-M0037c，伊莱瑞特)；一氧化氮(NO)测定试剂盒(A013-2-1，南京建成)；NOD样受体蛋白3(Nod-like receptor protein 3，NLRP3)抗体(DF7438，119 kD，Affinity)；IL-1β抗体(abx131988，53 kD，Abbexa)；诱导型一氧化氮合酶(iNOS)抗体(AF6270，131 kD，Affinity)；TNF-α抗体(17590-1-AP，26 kD，Proteintech)。

1.3 SCI小鼠模型制备及分组 参考文献[14]进行SCI小鼠造模(30只)。造模后，15只作为SCI组；对另外15只小鼠连续注射TPL[0.2 mg/(kg·d)] 7 d(TPL组)后，进行HE染色分析、运动康复评估、炎症因子分析、蛋白检测等。以正常小鼠为对照组(15只)。

1.4 细胞培养及分组 BV2细胞于含DMEM、10% FBS、1%青链霉素的完全培养基中，在培养箱37 ℃、5% CO2条件下培养。待细胞融合度达到80%时随机分对照组、LPS诱导组和TPL处理组。根据预实验结果，LPS诱导组采用100 ng/ml LPS处理细胞24 h；TPL处理组先用TPL(50 nmol/L)处理细胞30 min，再加LPS(100 ng/ml)处理24 h。收集细胞或细胞上清进行后续实验。

1.5 HE染色 小鼠组织脱水后二甲苯透明。透明后的组织块依次经3缸石蜡(60 ℃)进行浸蜡并包埋，并依次进行切片、烤片并脱蜡。于Mayer氏苏木素染液中染色5 min，自来水洗浸洗返蓝，于1%水溶性伊红染液中染色5 min，风干后中性树胶封片、镜检。

1.6 运动功能评分(BBB) 术后7 d将三组小鼠放入开口盆中，轻敲盆壁使其爬行，由2名研究人员观察小鼠臂、膝、踝关节行走、躯干运动及其协调情况并参考文献[15]进行评分，总分21分，0分为无运动能力，评分高低代表运动能力强弱。

1.7 ELISA检测 收集SCI组血清或BV2细胞上清，按照ELISA试剂盒操作说明依次加入生物素化抗体工作液、酶结合物工作液、显色底物、终止液，并于酶标仪上在450 nm波长处测量各孔光密度(OD值)。

1.8 NO检测 采集小鼠血液或细胞上清，按照说明书依次加入反应液，加样完成后混匀样本，静置10 min，550 nm酶标仪比色，测各孔OD值。NO含量(μmol/L)=(测定OD值-空白OD值)/(标准OD值-空白OD值)×标准品浓度(100 μmol/L)。

1.9 Western blot检测 利用RAPI裂解液提取小鼠组织中总蛋白及BV2细胞总蛋白，利用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，加入5×蛋白上样缓冲液煮沸制备样本，电泳分离蛋白样品并转膜，孵育对应一抗、二抗，滴加ECL发光液于PVDF膜上反应数分钟，待荧光带明显后用滤纸吸去多余的底物液，覆上保鲜膜，X光胶片压片后依次放入显影液显影、定影液定影，冲洗胶片。晾干胶片，扫描胶片，用Band Scan分析胶片灰度值。

1.10 免疫荧光检测 固定细胞爬片(4%多聚甲醛)，0.5 % Triton X-100通透15 min后使用封闭液对细胞封闭30 min。一抗4 ℃孵育过夜，二抗室温避光孵育1 h，滴加一滴封片剂封片后，荧光显微镜观察并拍照。

2 结 果

2.1 三组小鼠脊髓组织病理及BBB评分比较 造模7 d后， SCI组脊髓组织结构紊乱和组织排列异常严重，经TPL处理后得到明显改善(图1A)。同时，TPL组BBB评分优于SCI组(图1B)。

注：与对照组比较，*P<0.05；与SCI组比较，#P<0.05

2.2 三组小鼠脊髓组织促炎细胞因子水平比较 见表1。SCI组小鼠脊髓组织IL-1β、IL-6、TNF-α水平较对照组明显升高(均P<0.05)。注射TPL(TPL组)可显著降低IL-1β、IL-6和TNF-α水平(均P<0.05)。

表1 三组小鼠脊髓组织促炎细胞因子表达水平比较(pg/ml)

2.3 三组小鼠iNOS及NO水平比较 见图2。SCI组iNOS及NO水平较对照组升高，而TPL组可显著下调iNOS及NO水平(均P<0.05)。

注：与对照组比较，*P<0.05；与SCI组比较，#P<0.05

2.4 三组小鼠NLRP3及IL-1β水平比较 见图3。SCI可促进NLRP3及其相关蛋白IL-1β的表达，而TPL可显著抑制这些蛋白的表达。

注：与对照组比较，*P<0.05；与SCI组比较，#P<0.05

2.5 三组BV2细胞促炎细胞因子水平比较 见表2。LPS刺激24 h可加速BV2小胶质细胞IL-1β、IL-6、TNF-α的释放，而用TPL孵育后IL-1β、IL-6和TNF-α水平明显受到抑制。

表2 三组BV2细胞促炎细胞因子水平比较(pg/ml)

2.6 三组BV2细胞NO及iNOS水平比较 LPS处理24 h后BV2细胞中NO水平增加，经TPL处理后NO水平下降(图4A)。Western blot检测结果显示，LPS诱导BV2细胞在蛋白水平上增加iNOS表达，而TPL处理可显著下调iNOS表达(图4B、C)。

注：与对照组比较，*P<0.05；与LPS诱导组比较，#P<0.05

2.7 三组BV2细胞NLRP3及IL-1β水平比较 LPS刺激可促进NLRP3及其相关蛋白IL-1β在BV2小胶质细胞中的表达，TPL则可显著抑制这些蛋白的表达(图5A、B)。此外，经过TPL处理的BV2细胞NLRP3在核内荧光强度降低(图5C)。

注：与对照组比较，*P<0.05；与LPS诱导组比较，# P<0.05。C图为免疫荧光染色(×400)

3 讨 论

TPL是中药雷公藤中主要的生物活性化合物，在我国被广泛用作治疗药物已有数百年历史[5-7]。虽然TPL在抗炎方面的体内研究取得了相当大的进展，但其在SCI中是否具有抗炎作用及其具体的机制尚不清楚。最近的实验表明，多种促炎细胞因子，如巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)、IL-1β、IL-6和TNF-α等，在脊髓压迫损伤后持续升高。抗炎药物通过M1/M2表型变化调节小胶质细胞极化，减少神经炎症反应，进而抑制SCI诱导的继发性组织损伤的产生和扩大[11-12,16-17]。

NO是一种气体化学信使，是已知的生物活性最小的分子。低浓度NO与中枢神经系统生理过程密切相关，如突触可塑性、受体功能和神经递质释放。在包括SCI在内的病理条件下，NO主要由iNOS合成，在小胶质细胞、星形胶质细胞和血管平滑肌细胞中大量表达。然而，大量NO会导致氧化应激和炎症反应，形成神经系统疾病[18-19]。NLRP3炎症小体是研究最广泛的炎症小体，其参与无活性Caspase-1前体转化为活性形式过程。一旦激活，Caspase-1蛋白水解将促炎细胞因子IL-1β前体和IL-18前体转化为成熟IL-1β和IL-18，这可以驱动一个强大的炎症级联反应，最终放大炎症反应。在啮齿动物SCI模型中，抑制NLRP3炎症小体具有显著的神经保护作用，表明NLRP3炎症小体是SCI过程中的重要介质。因此，NLRP3炎症小体可能成为SCI药物治疗的新靶点。此外，NLRP3炎性小体的药物抑制剂BAY 11-7082或A438079可以促进小鼠SCI模型术后的神经恢复[19-21]。这些发现表明NO分子和NLRP3炎症小体可能是脊髓损伤治疗的靶点。

因此，本研究首先探究了TPL在BV2小胶质细胞中的抗炎作用，结果表明TPL能够抑制LPS诱导的BV2细胞的炎症反应，抗炎作用包括减少促炎细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表达，同时抑制iNOS表达从而抑制NO释放。机制分析表明，TPL的抗炎作用可能是通过抑制NLRP3炎性小体表达而实现的。其次，我们探究了TPL对SCI小鼠的作用，发现TPL提高了SCI小鼠的BBB评分，即TPL能有效促进SCI小鼠后肢运动功能的恢复。同时，HE染色观察脊髓形态学变化发现SCI组小鼠脊髓组织结构紊乱和组织排列异常严重，而TPL明显改善了SCI小鼠脊髓组织学形态。因此，TPL减轻了损伤组织紊乱，改善了术后运动功能。另外，SCI小鼠分子生物学实验结果与LPS诱导的BV2细胞一致，TPL处理抑制了SCI引起的脊髓组织IL-1β、IL-6、TNF-α高表达，亦可通过抑制iNOS表达进一步抑制NO释放，并且通过抑制NLRP3炎性小体表达在SCI小鼠中发挥抗炎作用。

综上所述，TPL可通过抑制NLRP3通路及iNOS-NO通路在BV2小胶质细胞及SCI小鼠模型中发挥抗炎作用，为SCI的治疗用药提供了理论支持。