内质网蛋白29在结直肠腺瘤和腺癌组织中的表达及临床意义

赵 健，牛森森，周玉保，Muhammad Ayyub(巴基斯坦)

(1.安徽医科大学第二附属医院消化内科，安徽 合肥 230601；2.安徽医科大学第一附属医院消化内科， 安徽 合肥 230601)

我国结直肠癌发病率和病死率在全部恶性肿瘤中均位居第5位[1]。由于结直肠癌早期症状和体征不典型，现有早期诊断、复发及转移监测等技术的敏感性和特异性仍不足，导致发病率和病死率居高不下，甚至出现上升趋势[2-4]。结直肠腺瘤是目前公认的具有不同程度异型增生的结直肠癌癌前病变，大部分结直肠癌被认为起源于良性的结直肠腺瘤[5]。目前对结直肠腺瘤的病理诊断主要依据组织的显微镜下形态学表现，带有一定主观性，难以准确描述腺瘤的病理学特征和判断其生物学行为，不利于结直肠肿瘤治疗的及时性和有效性。近年来，内质网蛋白29(Endoplasmic reticulum protein 29，ERp29)在多种恶性肿瘤中的生物学行为调控作用已经得到充分重视，研究[6]证实ERp29的异常表达会使相关蛋白失去执行其正常功能的能力，从而导致肿瘤等疾病的发生。然而，ERp29在结直肠肿瘤进展中扮演的角色尚有争议，确切的调控作用和分子机制也不清楚。到目前为止，ERp29在结直肠腺瘤中未见相关研究报道。本研究通过免疫组织化学染色法对比ERp29在结直肠组织癌变不同阶段组织中的表达情况，以验证其在结直肠肿瘤发生、发展中的确切作用，为ERp29在结直肠肿瘤中的研究提供补充。

1 材料与方法

1.1 一般资料 收集安徽医科大学第二附属医院2018年6月至2019年12月行肠镜下息肉切除的结直肠腺瘤组织60例(管状腺瘤、绒毛状管状腺瘤及绒毛状腺瘤组织各20例)，其中男性34例，女性26例，年龄40～77岁，平均年龄(61.67±10.13)岁。收集行外科手术治疗的结直肠癌组织及其对应癌旁组织各40例，其中男性22例，女性18例；年龄43～81岁，平均(62.45±11.61)岁。取同期行肠镜下切除的非腺瘤性息肉组织20例作为腺瘤对照，其中男性10例，女性10例；年龄36～81岁，平均(58.95±10.96)岁。各组在性别、年龄构成等常规资料比较上无统计学差异(均P>0.05)。所有标本经组织病理学检查确诊。排除术前接受过放化疗的结直肠癌患者。

1.2 染色方法 ERp29采用EnVision法进行染色。由我院病理科调取所需石蜡组织块，切成4 μm厚度，60 ℃烤片4 h后备用。切片常规脱蜡、水化，依次为二甲苯10 min×3次、无水乙醇3 min×3次、95%乙醇3 min×2次、75%乙醇3 min×2次，蒸馏水冲洗1 min，置于PBS缓冲液中。枸橼酸盐缓冲液经高压锅煮沸抗原修复，3% H2O2阻断内源性过氧化物酶，室温孵育10 min后加入ERp29抗体(工作浓度1∶ 200)，37 ℃孵育60 min。滴加反应增强液，室温孵育20 min，加入HRP标记的山羊抗兔IgG二抗，室温孵育20 min，DAB显色，室温孵育，自来水冲洗随时终止显色，苏木精复染20 s，分化、冲洗返蓝，梯度乙醇脱水，中性树脂封片。用PBS代替一抗作为阴性对照。

1.3 结果判定 以细胞质中出现棕黄色颗粒为ERp29阳性表达。在双盲条件下，由2名高年资病理医师在200倍镜下随机选取5个清晰无折叠视野，分别从染色强度评分(0～3分)和阳性细胞计数百分比评分(0～4分)进行评定并取平均值，通过两种评分乘积判断ERp29表达程度，得分越高则表达程度越高。评定标准：①染色强度评分：无染色记为0分，轻度染色记为1分，中度染色记为2分，重度染色记为3分。②阳性细胞计数百分比评分：阳性细胞<5%记为0分，5%～25%记为1分，26%～50%记为2分，51%～75%记为3分，>75%记为4分。≤2分判定为阴性(-)，2～4分为弱阳性(+)，5～8分为中等阳性()，9～12分为强阳性()，其中>2分判定为阳性表达。

1.4 统计学方法 应用SPSS 19.0统计学软件，通过χ2检验和Fisher确切概率法分析结直肠肿瘤组织中ERp29表达水平与临床病理参数的相关性，通过两样本比较的Wilcoxon秩和检验比较ERp29表达程度与结直肠不同类型病变组织之间的相关性。检验水准α=0.05。

2 结 果

2.1 ERp29在结直肠不同类型病变组织中表达情况比较 见表1(图1)。免疫组化染色结果显示，ERp29在结直肠良性病变及癌旁组织中多呈强阳性或中等阳性表达，在腺癌中多呈弱阳性或阴性表达。结直肠腺癌组织ERp29阳性率明显低于其癌旁组织、腺瘤组织和非腺瘤组织(χ2=10.208、16.407、12.377，均P<0.01)。腺瘤和非腺瘤组织间ERp29表达比较无统计学差异(P>0.05)。

表1 ERp29在结直肠不同类型病变组织中表达情况比较[例(%)]

A：非腺瘤性息肉组织；B：腺瘤组织；C：癌旁组织；D：腺癌组织

2.2 ERp29在结直肠不同类型病变组织中表达强度比较 见表2。结直肠腺癌组织ERp29表达强度显著低于其癌旁组织、腺瘤组织和非腺瘤性息肉组织(Zc=-4.540、-5.562、-5.349，均P<0.01)。腺瘤组织ERp29表达强度低于非腺瘤性息肉组织(Zc=-2.177，P<0.05)。

表2 ERp29在结直肠不同类型病变组织中表达强度情况(例)

2.3 ERp29表达与结直肠癌组织临床病理参数关系 见表3。通过卡方检验对比结直肠癌组织不同临床病理特征时ERp29表达阳性率的差异，可知ERp29表达水平与肿瘤TNM分期及淋巴结转移呈负相关(均P<0.01)，而与腺癌患者年龄、性别、肿瘤直径、肿瘤部位、肿瘤分化程度、肿瘤浸润深度(T分期)及有无癌栓无明显相关性(均P>0.05)。

表3 ERp29表达与结直肠癌组织临床病理参数关系[例(%)]

2.4 ERp29表达与结直肠腺瘤组织学类型和异型增生程度关系 见表4。绒毛状腺瘤组织ERp29阳性率(70%)低于管状腺瘤(90%)和绒毛状管状腺瘤(85%)，腺瘤伴重度异型增生组织ERp29阳性率(66.7%)低于轻中度异型增生组织(85.4%)，但差异无统计学意义(均P>0.05)。

表4 ERp29表达与结直肠腺瘤组织学类型和异型增生程度关系[例(%)]

3 讨 论

ERp29是一种分子量为29 kDa的内质网驻留蛋白，在真核生物多种组织中表达广泛，尤其在分泌性组织中有着高水平的表达[7]。ERp29和蛋白质二硫键异构酶样蛋白在结构和功能上具有许多相似性，充当分子伴侣协助内质网中某些特定蛋白质早期分泌途径中的加工和转运，并参与真核生物多种重要生命进程[8]。ERp29已被证实在包括结直肠癌在内的多种癌细胞侵袭、迁移、增殖与凋亡等过程中发挥重要作用，目前大多数研究[9-12]显示ERp29在各类恶性肿瘤发生与发展中扮演着抑癌因子的角色，然而另一些研究[13-14]发现ERp29同样高表达于某些原发肿瘤及癌细胞株。

在对结直肠癌的研究中，Deng等[15]证实高表达的ERp29是导致结直肠癌转移癌干细胞样细胞侵袭能力的先天因素，并可对结直肠癌的预后风险进行分层。Guo等[16]在对结直肠癌细胞株中的内质网应激(ERS)模型研究中发现ERp29表达上调，并通过与CUL5偶联在ERS期间逆转了ERS诱导的从间充质样到上皮样表型的转变(MET)过程，使癌细胞在遇到不利应激时也能够维持恶性生物活性，暗示ERp29高表达与结直肠癌转移和患者预后不良相关，而这与檀祝利等[17]的研究结果相反。

综上可见，ERp29的表达和作用可能受不同肿瘤组织类型、不同状态以及细胞内环境的影响而存在差异。基于ERp29在结直肠癌研究中出现了相互矛盾的结果，为探究ERp29在结直肠肿瘤中的确切作用，本研究利用免疫组织化学法检测了结直肠不同类型病变组织中ERp29的表达情况。结果显示，ERp29在各个类型组织中均有不同程度表达，非腺瘤、腺瘤及癌旁组织中ERp29多呈强阳性或中等阳性表达，腺癌中多呈弱阳性或阴性表达。腺癌组织中ERp29表达阳性率均显著低于其他3种类型组织，虽然在非腺瘤性息肉和腺瘤组织中ERp29表达阳性率无统计学差异，但在ERp29表达强度的比较中非腺瘤组织比腺瘤组织有着更高程度的表达，提示在非肿瘤至良性肿瘤再至癌的续变过程中ERp29表达减少可能是结直肠腺瘤癌变的重要分子事件，其表达下调贯穿于整个腺瘤癌变进程的各个阶段。

在对结直肠腺瘤的研究中，本研究证实ERp29阳性表达率在不同腺瘤组织学类型以及异型增生程度之间无统计学差异，但随着腺瘤绒毛成分和异型增生程度的增加，ERp29阳性表达率有逐渐降低趋势，提示ERp29异常表达可能与腺瘤恶性转化有关。Wu等[18]通过体内和体外实验证实ERp29可抑制胃癌细胞增殖，进一步的机制研究表明ERp29可通过阻断PI3K/AKT通路/GSK-3β或AKT-mTOR信号抑制上皮细胞-间充质转化(EMT)进程[19]。Bambang等[20-21]在对乳腺癌细胞中ERp29相关作用的研究中还证实了ERp29通过使β-catenin易位抑制活化的Wnt/β-catenin信号传导，在紧密连接和细胞极性恢复以及通过建立细胞-细胞接触在诱导肿瘤细胞MET中起关键作用。本研究结果也间接提示ERp29有抑制结直肠黏膜组织细胞异常增殖的作用，可能与上述作用机制相关。在ERp29表达与结直肠癌临床病理参数关系的研究中，本研究结果也与檀祝利等[17]研究结果基本一致，并且发现较大的肿瘤直径、较低的细胞分化程度、更深的浸润深度和癌栓存在使得ERp29的表达有逐渐降低的趋势，虽然它们未显示出明显统计学差异，但考虑到免疫组化检测的特异性和灵敏度相对不足，仍在一定程度上提示ERp29异常表达可能与结直肠癌的恶性行为有关。

总之，本研究证实ERp29作为一种抑癌因子参与了结直肠从非肿瘤至良性肿瘤再至癌的序列演变过程的各个阶段。可以推测，ERp29可能是一个更有效的分子生物学标志物，在结直肠腺瘤早期癌变倾向和程度的监测以及结直肠腺癌转移倾向的评估中有潜在应用价值，并在作为结直肠癌新的治疗靶点方面也具有一定的研究价值。