红景天苷通过抑制线粒体自噬通路减轻1-甲基-4-苯基吡啶离子诱导的PC12细胞凋亡实验研究

王松海，康 超，谢燕华，陈 捷，刘 楠

(陕西省中医医院肿瘤科，陕西 西安 710003)

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一种发生于中老年人的常见神经退行性运动功能障碍疾病。其病理改变为中脑黑质致密部多巴胺(DA)能神经元退行性变性丢失，纹状体区DA含量减少，以及残存的DA能神经元内形成以α-突触核蛋白为主要成分的嗜酸性包涵体——路易小体[1-2]。在北京大于 65 岁的人群中，男性患病率为1.7%，女性为1.6%[3]，基本与发达国家相同。目前临床治疗中主要是对症治疗，而减轻或抑制发病过程的药物尚未被发现。虽然流行病学对于PD的具体发病机制尚未清楚，但是线粒体功能障碍以及DA能神经元内氧化应激刺激被认为是引起该病的主要原因。近年来，中医药在神经退行性变中的应用，尤其是植物药对PD的神经保护作用，受到人们的广泛关注。红景天作为一个有价值的药用植物，我国自古就有将红景天用于煎汤或泡酒，作为补品或治疗疾病的药物使用的记录，以消除疲劳或抵御寒冷。红景天苷(Salidroside，Sal)主要是从红景天的根、块茎中提取出来的，具有较强的神经保护作用[4-8]。我们前期研究表明Sal具有抑制1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP+)诱导PC12细胞凋亡的作用，而其主要机制与减少细胞内氧化应激有关[9-10]。同时，我们还发现Sal对神经细胞的保护作用可能与抑制线粒体的破坏有关。因此，本研究将进一步探讨Sal对PD体外模型的神经保护作用机制，为研究Sal的治疗作用提供一些依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料 PC12细胞系由第四军医大学基础教学实验中心提供；Sal(HPLC 法检测纯度>98%，CAS：82373-94-2)购自四川维克奇生物科技有限公司；DMEM培养基、胎牛血清和马血清购自Gibco公司。MPP+(CAS：D048-100MG)、4-甲基偶氮唑蓝(MTT，CAS：298-93-1)、Annexin V-binding/PI-uptake(CAS：APOAF-20TST)、罗丹明123(CAS：62669-70-9)购自Sigma公司；兔抗大鼠PINK1、Parkin、LC-3、Beclin1抗体(一抗，ab216144、ab15494、ab48394、ab207612)以及β-actin抗体(一抗，ab8227)购自Abcam公司；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG的抗体(二抗，ZB-20301)购自北京中杉公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养：PC12细胞系培养于DMEM培养基(含10%马血清、5%胎牛血清、2 mmol/L L-谷氨酰胺、100 kU/L青霉素、100 g/L链霉素)中，置于含5% CO2的37 ℃孵育箱中培养。隔天换液，待单层细胞融合约80%时，用0.25%胰蛋白酶消化并传代培养。当传代细胞进入对数生长期时进行实验处理。

1.2.2 实验分组：根据实验需求分为四组。对照组：不加任何实验受试物。单纯药物组：在对照组的基础上加入100 μmol/L Sal。MPP+模型组：MPP+用培养液稀释(终浓度为500 μmol/L)，加入到培养孔中。不同剂量 Sal组：先分别加入终浓度为10、100 μmol/L的Sal，孵育24 h后加入MPP+，每组样本量为6～8个。

1.2.3 细胞活性检测：基于MTT在活细胞线粒体脱氢酶作用下可转变为蓝紫色甲瓒结晶进行检测。PC12细胞接种于96孔板，接种密度为1×105个/孔，每孔100 μl培养液。按实验要求进行药物干预后，吸尽培养液，PBS冲洗3遍，每孔加入5 mg/L MTT溶液20 μl，37 ℃下继续孵育3～4 h。小心去除培养液后，加入150 μl DMSO，震荡10 min，使蓝色结晶充分溶解，上酶标仪，以波长490 nm检测每孔吸光度值。细胞活性以与对照组相比的百分数表示。实验均重复3次。

1.2.4 凋亡细胞检测：用流式细胞仪Annexin V-binding和PI-uptake进行定量检测。用MPP+和(或)Sal处理后，将细胞通过离心收集，PBS冲洗，再以1×106个/ml的浓度悬浮于结合缓冲液中。加入5 μl 20 μg/ml Annexin V-FITC和10 μl 50 μg/ml PI，在室温下孵育15 min，避光。然后使用流式细胞仪进行细胞凋亡水平的定量分析。凋亡细胞以占总细胞数的百分比表示。实验均重复3次。

1.2.5 线粒体膜电位检测：按常规方法提取线粒体，用适量1×Assays Buffer重悬。常规方法进行蛋白含量测定后，用1×Assays Buffer调配成3 mg/ml的线粒体溶液。取2 ml 1×Assays Buffer和1 ml线粒体溶液，加入适量待测化合物(同时设空白对照组)，25 ℃保温5 min。加入罗丹明123染液10 μl，进行荧光光度计检测，测得的荧光值以与对照组细胞荧光度的百分比表示。实验均重复3次。

1.2.6 蛋白表达情况检测：采用Western blot检测LC-3β、Beclin1、PINK1、Parkin、β-Actin蛋白表达情况。提取的蛋白质先经BCA法测定蛋白浓度，再取20 μg蛋白样本进行Western blot检测，后进行ECL化学发光显影。结果采用凝胶图像分析仪进行灰度分析。实验均重复3次。

2 结 果

2.1 Sal与MPP+对PC12细胞活性的影响 见图1。通过MTT检测发现，单纯Sal对PC12细胞活性未见明显影响。MPP+具有剂量依赖性减少PC12细胞活力的作用，500 μmol/L MPP+处理24 h后，细胞活力显著下降至(52.4±2.2)%，与对照组比较有统计学差异(P<0.01)。因此，将500 μmol/L MPP+处理24 h作为模型组。不同浓度Sal(10、100 μmol/L)预处理24 h后，细胞活力分别恢复至(63.1±2.1)%和(84.1±1.3)%，与MPP+模型组比较均有统计学差异(均P<0.05)。

注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与MPP+模型组比较，#P<0.05，##P<0.01

2.2 Sal与MPP+对PC12细胞凋亡的影响 见图2。MPP+预处理后，凋亡细胞百分比从(2.26±0.13)%增加至(58.54±2.23)%，与对照组比较有统计学差异(P<0.01)。而在10、100 μmol/L Sal预处理后，细胞凋亡比例分别降至(39.13±1.45)%和(20.32±2.21)%，与MPP+模型组比较有统计学差异(均P<0.01)。

注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；

2.3 Sal与MPP+对PC12细胞线粒体膜电位(MMP)的影响 见图3。500 μmol/L MPP+处理PC12细胞后，罗丹明123信号降低至(48.64±2.34)%，与对照组比较有统计学差异(P<0.01)。而在10、100 μmol/L Sal处理后，MMP峰值分别升至(62.14±2.32)%和(86.31±2.35)%，与MPP+模型组比较有统计学差异(均P<0.01)。

注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与

2.4 Sal与MPP+对PC12细胞中相关蛋白表达的影响 见图4。 与对照组相比，MPP+处理后细胞内LC-3β、Beclin1表达增多，PINK1、Parkin表达减少(均P<0.01)。Sal预处理后，与MPP+模型组比较，细胞内LC-3β、Beclin1蛋白表达水平明显下降，而PINK1、Parkin蛋白表达水平明显上升(均P<0.05)。

注：与对照组比较，**P<0.01；与MPP+模型组比较，#P<0.05

3 讨 论

帕金森病1817年由Parkinson首次发现，目前是临床上老年人常见的神经退行性疾病。我国PD患病率高达1.7%，目前已严重影响国民生活质量。虽然PD治疗取得了一系列的成就，但其发病机制迄今仍不清楚，因为没有一种学说可以解释PD患者所有的临床症状。一般随着病程延长，PD临床症状经历由少至多、由轻至重的复杂变化。PD临床症状主要分为以静止性震颤、运动迟缓、肌强直、言语不利、平衡障碍为主的运动症状，和以认知功能障碍、感觉异常、自主神经功能障碍、睡眠障碍为主的非运动症状[11-12]。PD通常在临床症状明显及确诊之前，可能都伴有神经退行性病变，但目前主要的DA治疗并不能完全逆转神经元的凋亡，也不能彻底抑制PD病理改变，只能缓解其部分运动症状，而对一些非运动症状如焦虑、抑郁等无影响，甚至会加重便秘、低血压、幻视等症状。因此，对于PD的机制研究越来越多受到关注，希望能从源头寻找到彻底解决问题的方案[13-14]。有研究发现，PD的发病原因不能仅仅依靠基因学说完全解释，因为PD病例中大多数(≥95%)是散发的。总体来看，PD发病机制目前主要有运动神经元异常凋亡学说、线粒体功能障碍学说、氧化应激学说、内质网应激学说、免疫炎症反应学说、微生物-肠-脑轴调控机制学说、铁死亡调控机制学说等[15-19]。每一个学说都只能解释部分PD的发病现象，但PD发病中仍然有一些共同的生化病理特征，如残存神经元细胞内以α-突触核蛋白的大量聚集等。

研究表明Sal具有明显抑制细胞内氧化应激激活的作用，我们前期体外研究结果也表明Sal具有激活细胞内异常蛋白聚集清除系统(泛素蛋白酶系统)的作用，但进一步提高抗氧化物浓度并不能完全阻止多巴胺能神经元的损伤。有研究[20]在这些损伤的神经元细胞中发现存在线粒体功能障碍，其中有Caspase通路、泛素蛋白酶系统、自噬系统的激活。线粒体的功能障碍与活性氧生成以及能量增加密切相关，而PD患者黑质中线粒体复合物Ⅰ活性降低32%～38%，导致细胞有氧呼吸功能减弱，发生酸中毒及氧化应激。而氧化应激又将导致线粒体膜受损，引起膜电位去极化，使得细胞膜上PINK1蛋白被激活，激活后的PINK1蛋白转位到线粒体外膜，诱导下游Parkin在线粒体外膜聚集[21-22]。Parkin在线粒体外膜的聚集可以加强线粒体的分裂，从而有利于受损伤的线粒体被清除。同时，Parkin移位到线粒体后E3泛素连接酶的活性增加，引起多种线粒体底物泛素化，从而导致受损的线粒体被清除。Parkin介导线粒体泛素化后，泛素结合接头蛋白P62既可与线粒体底物结合，又可与LC-3、Beclin1结合介导泛素化线粒体进入自噬体，然后通过自噬体与溶酶体融合清除受损线粒体[23-24]。因此，对于Sal是否参与损伤细胞器的自动降解途径(自噬系统)，PD中多巴胺能神经元内线粒体损伤是否与自噬相关，仍需我们进一步研究。

本研究采用MPP+诱导的PC12细胞模拟PD体外模型，经 Sal预处理后细胞活性明显好转，凋亡情况明显改善。进一步研究发现模型组细胞内MMP水平明显降低，LC-3β、Beclin1表达增多，PINK1、Parkin表达减少，而经Sal预处理后上述损伤均可以明显改善。

综上所述，Sal对PD模型中DA能神经元的保护机制可能与激活线粒体自噬通路有关，这与我们前期PD体内动物实验的研究结果一致。本研究结果虽然对PD临床治疗具有一定的指导价值，但也有一定不足：首先，目前临床已有红景天苷的注射制剂，但临床目前主要应用于冠心病心肌供血不足，以活血化瘀为主要目的。对于红景天的抗氧化活性、改善神经元细胞功能活性的研究目前还处于实验研究节段。其次，PD发病机制复杂，虽然氧化应激反应是其主要发病机制，但是一般药物的抗氧化活性呈浓度依赖性，因此在保持临床效果的基础上如何确定Sal的临床最适浓度是我们下一步的主要研究方向。