结直肠癌患者肿瘤出芽情况与临床病理特征、程序性死亡受体1及程序性死亡配体1表达相关性研究

赵英旋，白玉勤

(1.锦州医科大学，辽宁 锦州 121001；2.赤峰学院附属医院普外科，内蒙古 赤峰 024000；3.赤峰市肿瘤医院病理科，内蒙古 赤峰 024000)

结直肠癌(Carcinoma of colon and rectum，CRC)是消化道常见的恶性肿瘤，表现为便血及腹痛等症状[1]。近年来，CRC发病率和死亡率逐渐呈上升趋势。据统计，CRC在全世界男性发病率中居第3位，病死率第4位；女性发病率居第2位，病死率居第3位；大多数患者处于中晚期，占所有CRC的50%[2]。欧洲医学肿瘤学会(ESMO)提出，肿瘤出芽是早期CRC的潜在预后因素，其是由一个未分化的肿瘤细胞或4个细胞组成的小的局灶性肿瘤细胞群，存在于肿瘤浸润的前缘，CRC中肿瘤出芽与微卫星不稳定性、细胞凋亡、肿瘤间质、缺氧和血管扩张、炎症浸润、微小RNAs(miRNAs) 、Ki-ras及KRAS/BRAF基因突变密切相关[3]。研究[4]发现，程序性死亡受体1(Programmed cell death-1，PD-1)是一种参与T细胞凋亡的跨膜受体，其与程序性死亡配体1(Programmed cell death-ligand 1，PD-L1)和PD-L2的相互作用会抑制T细胞的增殖。当正常机体感染病毒时，细胞内PD-L1和PD-L2蛋白的表达增加，与T细胞表面的 PD-1 受体相互作用，从而抑制T细胞的活化和增殖，降低杀伤肿瘤能力[5]。基于此，本研究选取180例手术切除的CRC石蜡标本，探讨CRC患者肿瘤出芽与临床病理特征及PD-1/PD-L1的关系，以期为CRC诊治提供实验依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 回顾性分析2014年1月至2015年12月行根治术治疗的180例CRC患者的临床资料。其中，男性65例，女性115例；年龄30～75岁，平均(57.26±7.18)岁；肿瘤直径1.5～10 cm，平均(4.51±0.30)cm。病例纳入标准：①均符合CRC诊断，并经病理学确诊[6]；②年龄30～75岁；③临床资料及影像学资料完整；④术前未接受化学药物治疗、局部放射治疗或其他抗肿瘤治疗；⑤无恶性肿瘤病史。排除标准：①肝肾功能不全；②合并自其他恶性肿瘤；③术前发生全身转移；④临床资料不完整；⑤有家族遗传史。

1.2 研究方法

1.2.1 肿瘤出芽计数：根据国际肿瘤出芽共识会议(ITBCC)上提出的肿瘤出芽标准化方法[7]进行判定，即在肿瘤浸润前沿的间质中发现孤立的单个肿瘤细胞或2～4个小簇状肿瘤细胞群为肿瘤出芽。低倍显微镜下观察苏木精-伊红(HE)染色的肿瘤组织浸润前沿，寻找肿瘤出芽最多的区域。如果不清楚哪个区域出芽最多，或者如果第一个区域的肿瘤芽数<15个，则应从多个区域评价肿瘤出芽，选择出芽最多的区域进行分析。在总放大倍数为200倍的条件下，对面积为0.398 mm2的单个视野内的肿瘤芽数进行计数，然后将肿瘤芽数乘以1.97，得到的数为每0.785 mm2的肿瘤芽数，在光镜下观察到CRC中没有出芽、低度出芽(<10个/高倍视野)和高度出芽(≥10个/高倍视野)(×20视野，0.785 mm2区域)。

1.2.2 标本制备和石蜡切片HE染色：离体的黏膜薄切和根治CRC组织标本快速在10%中性甲醛溶液中进行浸泡固定，采取组织梯度酒精脱水、透明、浸蜡，然后石蜡包埋。石蜡切片厚度为3 μm，于65 ℃温度下烘烤2～5 h后浸泡于二甲苯溶液中脱蜡，室温下梯度酒精脱苯及水化，酒精浓度依次为100%、95%、90%、80%和70%。接着采用流水冲洗3～5 min；苏木素溶液染色2 min，流水冲洗 3 min；用1%盐酸酒精溶液再浸泡1 min 后同样采用流水冲洗3 min；再用伊红溶液染色3～5 min，流水冲洗3 min；梯度酒精再脱水，酒精浓度依次为70%、80%、90%、95%和100%。3次二甲苯透明后采用中性树胶封片，于放大倍数下观察切片并记录[8-9]。

1.2.3 免疫组织化学染色：采用罗氏机器自动化方法。连续石蜡切片厚度为3 μm。取CRC组织石蜡切片，经烤片、脱蜡、水化、抗原修复等过程，加入体积分数为3%过氧化氢灭活内源性过氧化物酶后，加入一抗 anti-PD-L1和PD-1(克隆号为MX033)，4 ℃冰箱过夜(12 h)，PBS清洗，先后加入羊抗鼠或兔IgG(二抗)室温孵育1 h，DAB染色，苏木素复染，二甲苯透明，中性树胶封片[10-11]。

1.2.4 判定标准[12]：PD-L1和PD-1以细胞质或胞膜出现黄至棕褐色颗粒为阳性。PD-L1以阳性肿瘤细胞数≥1%为阳性，<1%为阴性。PD-1表达于肿瘤间质浸润的淋巴细胞，以≥5%为阳性，<5%为阴性。

1.3 统计学方法 采用SPSS 20.0统计学软件处理数据。计数资料用[例(%)]表示，组间比较采用χ2检验。等级资料采用秩和检验。采用多因素Logistic回归模型分析肿瘤出芽情况与临床病理特征的相关性。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 CRC患者肿瘤不出芽时PD-1和PD-L1蛋白表达情况 见图1。CRC不出芽石蜡标本连续切片行HE染色及免疫组化PD-1、PD-L1蛋白染色，60例CRC患者显微镜下未见肿瘤出芽，且PD-1、PD-L1蛋白呈阴性表达。

注：A图为HE染色(×40)；B、C图为PD-1蛋白免疫组化染色(×40)

2.2 CRC患者肿瘤出芽时PD-1和PD-L1蛋白表达情况 见图2。显微镜下，在肿瘤浸润的前缘间质内可见多个芽孢，且由孤立单个细胞或2～4个癌细胞成团组成，其中50例低出芽(图2A-D)，70例高出芽(图2E-G)。芽孢内细胞质融合，呈嗜酸性，形状不规则，染色较间质细胞深，部分可见核分裂像。肿瘤细胞PD-1、PD-L1蛋白不着色或着色<1%。PD-1表达于肿瘤间质及淋巴细胞，局灶区阳性细胞数<5%。因此，PD-1、PD-L1蛋白亦呈阴性表达。

注：A、E 图为HE染色(×40)；B、F图为HE染色(×400；)； C、G图为PD-1蛋白免疫组化染色(×40)；D、H图为PD-L1蛋白免疫组化染色(×40)

2.3 CRC患者肿瘤出芽与临床病理特征单因素分析 见表1。CRC肿瘤低出芽和高出芽患者性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤大小、肿瘤组织学、肿瘤分化程度及肠壁环绕情况比较无统计学差异(均P>0.05)，但病理分期、肿瘤形态、肠壁浸润深度及转移情况比较差异具有统计学意义(均P<0.05)。

表1 CRC患者肿瘤出芽与临床病理特征单因素分析[例(%)]

续 表

2.4 影响CRC肿瘤出芽临床病理特征多因素分析 见表2。将表1中有统计学差异的因素设为自变量(病理分期Ⅲ期=1，Ⅱ期=0；肿瘤形态呈侵袭型=1，呈肿块型和溃疡型=0；肠壁肌层和浆膜层浸润=1，黏膜层和浆膜外浸润=0；有淋巴结转移=1，无淋巴结转移和远处转移=0)进行Logistic多因素回归分析，结果显示病理分期、肿瘤形态、肠壁浸润深度及转移情况为影响CRC肿瘤出芽的独立危险因素(均P<0.05)。

表2 影响CRC肿瘤出芽临床病理特征多因素分析

2.5 CRC肿瘤出芽与预后的关系 对低出芽和高出芽患者进行5年随访。至2021年1月，随访时间平均(30.28±4.05)个月。随访期间无失访，低出芽CRC患者7例死亡，总生存率为86.00%(43/50)；高出芽CRC患者32例死亡，总生存率为54.29%(38/70)。高出芽CRC患者5年总生存率低于低出芽CRC患者(P<0.05)。

3 讨 论

CRC患者恶性肿瘤特征为肿瘤细胞侵袭性生长和转移。肿瘤侵袭性生长是肿瘤细胞进入周围间质，而肿瘤出芽是肿瘤侵袭性生长的形态表达，其除与CRC淋巴结转移、预后等相关外，还与微卫星不稳定性(MSI)、细胞凋亡、缺氧、炎细胞浸润等密切相关[13-14]。UICC已经正式承认肿瘤出芽是CRC的独立预后因素[15]。Pan等[16]发现，有淋巴结转移和淋巴管浸润的直肠癌患者，其肿瘤出芽的发生高于无淋巴结转移的直肠腺癌患者。杨天宁等[17]发现，肿瘤出芽在CRC淋巴结转移和淋巴管浸润方面的发生率具有相关性。

PD-1及其配体PD-L1是免疫治疗的重点。其中，PD-1正常表达在胸腺细胞上，诱导性表达于活化的T细胞、B细胞及自然杀伤细胞等，当抗原清除、免疫应答完成后T细胞PD-1表达减少。PD-1表达在T细胞上会诱导T细胞衰竭，因此PD-1属于免疫抑制受体。PD-L1是PD-1主要配体，是负性免疫调节蛋白，表达于肿瘤细胞、巨噬细胞和T细胞等，可抑制T细胞活化，促进细胞凋亡，减弱免疫系统对肿瘤细胞的监视作用，从而使肿瘤细胞发生免疫逃逸。肿瘤发生时肿瘤微环境会诱导浸润性T细胞高表达PD-1分子，进而激活肿瘤微环境中PD-1通路，且与PD-L1联接后会抑制T细胞功能[18-19]。本研究结果显示，肿瘤出芽率为66.67%(120/180)；CRC肿瘤不出芽区域和出芽区域肿瘤细胞PD-1和PD-L1蛋白不着色或<1%着色，PD-1表达于肿瘤间质浸润的淋巴细胞及间质细胞，局灶阳性细胞数<5%，结果为阴性，证明了CRC肿瘤不出芽和肿瘤出芽与PD-1和PD-L1蛋白表达无显著关系。另外，本研究发现低出芽和高出芽CRC患者病理分期、肿瘤形态、肠壁浸润深度及转移情况比较差异具有统计学意义，与陈艳昕等[20]报道一致，说明肿瘤出芽与病理分期、肿瘤形态、肠壁浸润深度及转移情况密切相关；同时Logistic多因素回归分析结果显示，病理分期、肿瘤形态、肠壁浸润深度及转移情况为影响CRC肿瘤出芽的独立危险因素，进一步证实了肿瘤出芽与病理分期、肿瘤形态、肠壁浸润深度及转移情况的相关性，病理分期高、肿瘤呈侵袭型、肠壁肌层和浆膜层浸润以及存在远处转移的CRC患者肿瘤出芽发生率更高。与其他研究不同的是，本研究进行5年随访后研究发现，高出芽CRC患者5年总生存率低于低出芽患者，由此可见高出芽CRC患者预后较差，进一步证实了肿瘤高出芽对CRC具有一定的预测价值。

综上所述，肿瘤不出芽和出芽与PD-1、PD-L1蛋白表达无相关性。病理分期、肿瘤形态、肠壁浸润深度及转移情况等病理特征是影响CRC患者肿瘤出芽的危险因素，可为制定术后辅助治疗方案和判断预后提供指导。但本研究纳入病例数较少，可能对结论有一定影响，后续将扩大样本量进一步论证。