基于网络药理及分子对接技术对人参治疗非小细胞肺癌作用机制研究

邸金娜，刘敬禹，张 莉

(锦州医科大学附属第三医院呼吸内科，辽宁 锦州 121001)

肺癌大多起源于支气管黏膜上皮，也称支气管肺癌。据统计，2019年全球有1810万新增癌症患者，我国癌症患者约380.4万例，其中肺癌发病率为11.8%，病死率为18.4%[1]。而非小细胞肺癌(Non-small-cell lung cancer，NSCLC)可占所有肺癌病例的83%，其5年相对生存率仅为18%[2-3]。近年来中药在预防及治疗NSCLC上显现出独特优势，并逐渐受到研究者的重视。人参作为常用的中药材，具有大补元气、复脉固脱、补脾益肺等功效，临床上应用广泛。大量研究[4-6]表明，人参可通过抑制细胞增殖、诱导细胞周期阻滞、促进细胞凋亡、影响细胞分化等达到治疗NSCLC的目的。但因人参成分复杂，对于其治疗NSCLC的药效物质基础及机制，目前仍不明确。基于网络药理学方法，本研究构建“成分-靶点-疾病-通路”蛋白相互作用(PPI)网络，预测人参治疗NSCLC核心靶点及机制，为人参治疗NSCLC提供参考。

1 资料与方法

1.1 人参活性成分收集 以“人参”为检索词，从中药系统药理数据库和分析平台(TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php)对所有药物成分数据库进行筛选和构建。筛选条件：口服生物利用度(OB)≥30%，类药性(DL)≥0.18[7]。搜索中医药整合药理学网络计算研究平台(TCMIP，http://www.tcmip.cn/TCMIP/index.php)整合药物潜在活性成分和相应靶标信息，获得人参活性成分-靶点数据，导入Cytoscape软件，建立人参-靶点PPI网络。

1.2 NSCLC-靶点PPI网络构建 利用比较毒物遗传学数据库(CTD，http://ctd.mdibl.org)、基因名片数据库(Gene Cards，https://www.genecards.org)和疗效药靶数据库(TTD，http://db.idrblab.net/ttd/)，以关键词“non-small-cell carcinoma”检索获取NSCLC基因。通过Draw Venn Diagram(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)将人参和NSCLC基因进行整合，选取交集基因导入Cytoscape软件建立NSCLC-靶点PPI网络。

1.3 人参-靶点-NSCLC PPI网络构建 利用Cyto NCA插件对交集网络进行分析[8]，建立人参-靶点-NSCLC PPI网络。保存PPI网络数据文件，根据Degree值中位数筛选核心靶点。

1.4 基因富集分析 运用DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov/)对核心靶点进行基因本体论(GO)注释和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析。以P≤0.01为限定条件，从基因生物功能和信号通路角度进一步明确人参对NSCLC的作用机制。

1.5 分子对接模拟 利用RCSB PDB数据库(http://www.rcsb.org/)输入相关蛋白质名字，并下载mol2格式靶点结构文件，通过软件Auto Dock Tools1.5.6调整X、Y、Z坐标并进行分子对接模拟。对接完成后用DS软件显示对接后作用力。若对接评分<4.25，则分子和靶点亲和力不强；>4.25，则有中等亲和力；>5，则有较强亲和力；>7，则有强烈亲和力[9]。

2 结 果

2.1 人参-靶点PPI网络 见图1。根据TCMSP共筛选出22个人参成分，其中马尔肯久纳醇(Malkangunin)、五味子酯乙(Gomisin B)、菊黄质(Chrysanthemaxanthin)、苯代南蛇碱(Celabenzine)成分无对应靶点蛋白，进一步检索人参18个成分作用靶点共118个。将人参成分及对应靶点导入Cytoscape软件，生成人参成分-靶点PPI网络。

图1 人参成分-靶点PPI网络

2.2 NSCLC-靶点PPI网络 通过TTD筛选出22348个NSCLC靶点蛋白，通过Gene Cards和CTD分别筛选得到4180个和148个靶点蛋白，进一步利用Veen筛选出79个共有靶点，并利用Cytoscape软件生成NSCLC-靶点PPI网络，结果显示与NSCLC相关节点蛋白质3675个，边缘蛋白质85921个。

2.3 筛选核心靶点 建立“人参成分-靶点-NSCLC”PPI交集网络(图2)，最终可以得到93个核心靶点蛋白。分析PPI网络中靶点Degree值，最大值为12，中位数为2。将靶点筛选条件范围设置为4～12，筛选得到26个核心靶点蛋白。

图2 人参-靶点-NSCLC PPI网络

2.4 GO注释分析和KEGG通路分析 GO注释分析结果显示有9个基因有注释数据，42个生物过程中有富集，其中符合P≤0.01的生物过程有12个。KEGG通路分析结果显示有26个基因有注释数据，56条通路有富集，其中符合P≤0.01的信号通路有35条。GO注释分析和KEGG通路分析共同富集结果有细胞周期(Cyclin)、表皮生长因子受体(EGFR)信号通路、鼠双微体(MDM)2/4信号通路、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路等。

2.5 人参成分与NSCLC靶点模拟对接结果 见图3。人参成分与PIK3CG、CDK2、EGFR、MET等成分具有较强亲和力。通过DS软件分析发现，人参成分与以上靶点均可形成H键及疏水作用，其中人参成分中西托糖苷(Alexandrin)、灌木远志酮 A (Frutinone A)、原阿片碱(Fumarine)等成分评分均优于EGFR抑制药奥希替尼(对接评分=8)和MET抑制药克唑替尼(对接评分=8)。分子对接结果与网络筛选结果一致，且人参活性成分与阳性药奥希替尼和克唑替尼相比，分子对接吻合度比上市的阳性药物效果更好。

图3 人参成分与NSCLC靶点对接评分

3 讨 论

本研究通过TCMSP筛选人参有效活性成分，显示人参有380种成分，其中满足条件的有邻苯二甲酸二异辛酯(Diop)、豆甾醇(Stigmasterol)、β-谷甾醇(β-sitosterol)等22个成分，进一步筛选出各成分对应的靶点共118个，构建成分-靶点PPI网络。再利用TTD、GAD、Gene Cards筛选出79个NSCLC作用靶点，并构建疾病-靶点PPI网络。通过将两个PPI网络整合建立成分-靶点-疾病PPI网络，其中CDK2、EGFR、MDM2等26个靶点的Degree值较高，确定为人参治疗NSCLC潜在核心靶点。通过富集分析发现，人参成分可通过干预细胞周期、EGFR信号通路、MDM2/4信号通路、MAPK信号通路等发挥治疗NSCLC的潜在作用。

人参中的灌木远志酮 A(Frutinone A)、原阿片碱(Fumarine)、吉九里香碱(Girinimbin)、高丽槐素(Inermin)、苏齐内酯(suchilactone)均可与靶蛋白EGFR、原癌基因蛋白质(MET)显现出良好的分子对接活性，9种活性成分和EGFR靶蛋白的对接区域与内源性配体结合位置基本相同，因此可能起到和内源性配体相同的作用，且人参活性成分与阳性药奥希替尼和克唑替尼相比，分子对接吻合度比上市的阳性药物效果更好。研究[10-12]表明，EGFR基因突变发生于39%～81%的NSCLC患者，与癌胚抗原基本一致。EGFR属于受体酪氨酸激酶(RTK)的ErbB家族，EGFR突变可持续激活下游通路，促进增殖、存活、侵袭和血管生成[13]。而PI3K-AKT通路是EGFR的主要下游信号通路之一，当EGFR发生突变时，PI3K-AKT通路被持续激活，加速NSCLC的进展[14]。有研究[15-16]表明，EGFR基因突变还能通过激活下游MAPK信号通路上调程序性死亡受体-1(PD-1)、程序性死亡受体-配体1(PD-L1)和细胞毒T淋巴细胞抗原4蛋白的表达，最终导致肿瘤发生免疫逃逸。此外，EGFR调控的信号通路还有FoxO、PLC-g以及RAS-RAF-MEK等[16-18]。

MDM2/4基因在NSCLC发生及发展中越来越被重视，是最为重要的负性调控因子。如果改变MDM2/4蛋白水平，MDM2/4和p53之间的平衡就会受到破坏[19]。p53作为一种编码的核磷蛋白，被广泛认为是细胞中一种重要的肿瘤抑制因子[20-21]，人参中β-谷甾醇、苯代南蛇碱(Celabenzine)、原阿片碱、人参皂苷Rg5(Ginsenoside Rg5)MDM2/4蛋白具有较强的亲和力，因此以上活性成分可通过调控MDM2/4蛋白来控制p53水平，从而达到治疗NSCLC的目的。

除EGFR、MET、MDM2/4外，人参治疗NSCLC的作用机制还可能是通过抑制肿瘤细胞有丝分裂、抑制PI3K-AKT信号通路激活、参与cAMP信号转导等生物过程影响肿瘤基因的表达，充分体现出了人参治疗NSCLC具有多靶点、多通路的特点。尽管有这些重要发现，本研究仍存在许多局限性：首先，由于信息不完整，可能忽略了某些化合物在NSCLC中的作用。其次，我们还未进行临床研究和动物模型实验，具体机制尚不清楚，需要在临床实验中进一步分析。因此，有必要进一步研究人参重要的单一组分在病理过程和特定靶标中的功能。