泛素化在脑缺血-再灌注损伤中的研究进展

张娟 殷博凯 郭艳芹 何治

翻译后蛋白修饰可以动态地重新规划细胞蛋白的特性和功能，以应对机体内环境失衡，泛素化就是其中一种[1]。泛素可以影响蛋白质的稳定性、定位、相互作用力和功能，在生理条件下泛素化对大部分真核细胞至关重要，并且在氧化应激、基因毒性、热应激等应激条件下其重要性更加突显[1]。研究表明，局灶性脑缺血和全脑缺血后，泛素化底物蛋白水平升高[2]。脑缺血后泛素化水平的升高是一个尚未被充分研究的领域，更好地理解泛素化有助于开发新的卒中治疗方法。笔者旨在对泛素化的研究进展、泛素化与应激的关系、泛素化与神经细胞的关系、泛素化与脑缺血-再灌注损伤的关系、脑缺血-再灌注损伤诱导的泛素化类型及脑缺血后泛素化升高的潜在因素进行综述。

1 泛素化

1.1 泛素化过程

在真核细胞中，泛素化是泛素(一类低分子量的蛋白质)分子以泛素单体或泛素链形式与底物蛋白共价结合时发生的一种高度通用的翻译后蛋白修饰过程[1]。泛素具有7个赖氨酸位点(K6、K11、K27、K29、K33、K48和K63)和位于N端的甲硫氨酸位点，易发生自泛素化进而延伸形成不同类型的多聚泛素链[3]。泛素分子与底物的结合需要活化酶、偶联酶和连接酶的连续作用，在第1步中，活化酶水解三磷酸腺苷将1个泛素分子腺苷酰化，通过活化中心的半胱氨酸残基与泛素C端甘氨酸形成硫酯键来活化泛素，之后泛素依次转移到偶联酶和连接酶，连接酶进而招募特定底物蛋白并使赖氨酸残基的氨基与泛素分子的C端羧基形成异肽键，从而完成泛素化修饰[4]。底物蛋白被蛋白酶体识别前，必须被标记至少4个泛素分子(以多聚泛素链形式存在)[3]。

1.2 泛素化的复杂性

泛素显著影响蛋白质功能，一方面源于结合系统的复杂性，另一方面源于泛素形成不同拓扑结构聚合物的能力[5]。虽然哺乳动物细胞中只有2种活化酶，但约有40种偶联酶和600种连接酶，它们有可能以一种混合搭配的方式协同工作产生约25 000种不同的结合对，特异地驱动底物蛋白，还有100多种去泛素酶也可以从底物中去除泛素[6]。除了结合系统的多样性，泛素化的复杂还因其具有8个结合位点，形成至少8个不同的联系[3]。虽然不常见，但也能观察到混合链，即在1个泛素分子中同时有2种及以上赖氨酸位点进行链接[7]。泛素还可以作为单体附着在底物蛋白中的1个或多个目标位点上[7]。不同的泛素链具有不同的功能，因此泛素化蛋白的命运严重依赖于相关泛素的结构。除少数情况外，K48链作为降解信号，K11和K29链也作为蛋白酶体识别进行降解的信号[8]。相反，泛素单体、K63链及甲硫氨酸链是完全不可降解的信号[9]。这是由于K11、K29和K48聚合物的三维形状与甲硫氨酸链、K63链及泛素单体不同[9]。因此，单体分子泛素化与通过不同链的泛素化具有完全不同的修饰，它们以不同的方式决定蛋白质的命运。

1.3 泛素化的重要性

在任一特定的时间，细胞中有超过5 000种蛋白质被泛素化，约占人类编码蛋白质的1/4[10]。因此，泛素化对细胞稳态的影响巨大。20世纪80年代初泛素化被发现初期，仅被作为蛋白降解信号。随着研究的深入，逐渐认识到泛素化与细胞众多过程密切相关，包括细胞周期控制、酶激活、信号转导、转录和DNA修复、受体转运、免疫反应、炎性反应和凋亡等[5]。

2 泛素化与应激

除了控制重要的生理功能外，泛素系统在细胞应激反应中也起着重要的作用。泛素偶联物的增加可发生在所有类型的应激过程中，如热休克、氧化剂、重金属、DNA损伤剂等。哺乳动物细胞，包括神经细胞，在应激的诱导下增加了泛素数量[11]。此外，泛素活化酶、偶联酶和连接酶的活性和表达也随着应激反应而升高[11]。泛素对细胞的保护是通过降解和非降解机制介导的，如被K48泛素修饰的蛋白质会被26S蛋白酶体识别并降解[9]。另外，虽然非降解泛素链在应激反应中的作用尚未被广泛研究，但是K63泛素的缺失降低了细胞对氧化应激的抵抗[12]。由于氧化应激是缺血过程的一个组成部分，因此在缺血的神经细胞中泛素对氧化应激的调节十分重要。

3 泛素化与神经细胞的关系

4 泛素化与脑缺血-再灌注损伤的关系

脑缺血带给受影响的大脑区域细胞巨大压力，而脑细胞对这种压力的反应之一就是泛素化的增加。1991年Hayashi等[18]首次发现脑缺血会升高大鼠海马区域泛素免疫反应活性，并出现大量泛素化相关蛋白。Hayashi等[19]后续报道了沙鼠皮质和海马局部缺血-再灌注早期泛素化增加，30～60 min达到峰值，12～24 h趋于消退。在大鼠和小鼠局灶性脑缺血2种模型中，泛素化需要再灌注，这是由于在再灌注前，缺血组织中对泛素结合至关重要的三磷酸腺苷供应受到限制。另外，再灌注为泛素化提供诱导信号，如通过产生自由基或激活与兴奋毒性等相关的信号级联[19-20]。大鼠纯缺氧损伤在缺氧后恢复期并未增加泛素化，这表明血流量的缺乏和重建可能对泛素化的激活至关重要[21-22]。然而，需要更多的研究来证实这一点，因为其中一项研究采用的是轻度缺氧(15%的氧气浓度)，机体的代偿系统可能会缓解缺氧带来的压力[21]；另一项研究是在未成熟的大脑中进行，未成熟大脑某些神经传递系统发育不成熟或相关酶供应不足，不能有效地引起泛素化的增加[22]。

目前动物实验表明，缺血后泛素化可通过再灌注立即诱导，并在梗死周围具有生存潜能的神经细胞中检测到[20]。在全脑缺血模型中，易受缺血应激影响的海马CA1区和皮质泛素化程度增加[23]。在损伤后恢复正常形态的神经细胞中，泛素化的升高是短暂的，而在死亡的神经细胞中泛素化水平很高[23]。在脑缺血大鼠中，低温可保存缺血后海马CA1区泛素免疫反应活性，减少缺血后泛素化的启动[24]。虽然经过治疗的脑缺血大鼠海马CA1区泛素化水平降低[25]，但是泛素化的升高可能不是神经细胞死亡的原因，而是防止这些神经细胞立即死亡的补偿性保护机制的一部分[26]。某些缺血模型中泛素化的减少可能是由于缺血程度轻致神经细胞压力较小[27]。泛素化在再灌注开始后、任何细胞死亡发生之前，以及在未造成任何损害的损伤后，均可立即和短暂地升高[22]，并且泛素化水平会随着缺血时间的延长而增加，这可能只是反映了更高的应激水平[27]。

5 脑缺血-再灌注损伤诱导的泛素化类型

为了预测泛素化对靶蛋白的影响，有必要评估相关泛素类型。质谱分析发现，全脑缺血模型中普遍存在的泛素链包括K6、K11、K48、K63链[28]。局灶性缺血模型中，用赖氨酸特异性抗体检测到K48和K63链[29]。可降解和不可降解泛素链的存在表明，蛋白酶体介导的降解作用减少不是缺血后泛素化水平升高的唯一原因。在Psmc1基因敲除抑制26蛋白酶体表达的小鼠中，局灶性脑缺血后不能诱导代表不可降解信号的K63泛素链[18]，提示缺血后泛素化水平升高存在其他机制。

6 脑缺血-再灌注损伤后泛素化升高的潜在因素

对大鼠短暂性脑缺血前后泛素基因的差异表达进行分析显示，相关基因表达的增加发生得太晚，无法解释缺血后泛素化的增加，也证实泛素化的升高不是由于泛素化相关底物蛋白的增加[30]，因为底物蛋白的增加必然伴随着自由泛素的耗损[20]。后续研究发现，泛素化水平的增加涉及多方面因素。

6.1 泛素结合机制成分变化

Hsc70羧基末端反应蛋白是一种泛素连接酶，在应激过程中控制伴侣蛋白的活性和水平。其在体外海马切片中的过表达，可防止氧糖剥夺诱导的神经细胞死亡[31]。然而，神经前体细胞表达发育抑制蛋白4 (neuralprecursor cell-expressed developmentally down-regulated 4，Nedd4)作为一种泛素连接酶在神经细胞局部缺血时表达增加，提示它们与神经保护有关[32]。Nedd4适配器蛋白(Nedd4 family interacting protein 1，Ndfip1)可在卒中过程中发挥保护作用，因为Ndfip1敲除小鼠表现出更大的梗死体积[33]。脑缺血后蛋白水平改变的另一泛素连接酶是帕金蛋白。成神经细胞瘤细胞的氧糖剥夺及小鼠局灶性缺血均能降低帕金蛋白水平，导致线粒体破碎和潜在的内质网应激[34]。与其他泛素连接酶一样，帕金蛋白也具有神经保护作用。综上所述，缺血后泛素水平的升高可能是泛素结合机制成分变化所致。

6.2 泛素去结合机制成分变化

泛素羧基末端水解酶L1(ubiquitin carboxy terminal hydrolases L1，UCH-L1)是一种在神经细胞中高表达的去泛素酶，其在帕金森病和阿尔茨海默病中的保护作用引起了人们的关注[35]。与神经退行性变性疾病类似，UCH-L1过表达可保护神经细胞免受缺氧损伤[36]，而成神经细胞瘤细胞中UCH-L1活性下调可增加氧糖剥夺诱导的细胞死亡[37]。UCH-L1被缺氧药物抑制24 h后，会增加原代神经细胞的泛素化蛋白表达[36]。另一个可能在卒中和神经退行性变性疾病中起作用的去泛素酶是泛素特异性蛋白酶14(ubiquitin specific protease14，USP14)，它通过修饰K48链调控泛素化蛋白的蛋白酶体降解[38]。抑制USP14能增强蛋白酶体活性促进Tau蛋白降解，在阿尔茨海默病细胞模型中具有保护作用[39]。注射特定的USP14抑制剂可减轻局灶性缺血小鼠神经细胞损伤，这种保护作用可能与缺血24 h后检测到的蛋白酶体活性增强和泛素化蛋白减少有关[40]。目前不清楚泛素化蛋白的减少是否具有神经保护作用，或者只是在这个时间点上减少损伤的一种措施。需要更多的研究来观察早期的再灌注时间，以便在缺血后将USP14与泛素化连接起来。

6.3 泛素化结合物清除减少

6.3.1蛋白酶体：蛋白酶体是一种有多种蛋白水解酶活性的多亚基复合物，具有泛素依赖性。泛素化增加可能是由于蛋白酶体对泛素化相关蛋白降解减少而引起，经典的26S蛋白酶体活性在缺血和再灌注期间明显降低[20,40]，如通过预处理维持缺血后蛋白酶体活性的大鼠，可以减少短暂全脑缺血后的蛋白质泛素化[41]。但是转基因过表达一种增强蛋白酶体降解的蛋白酶体适配器蛋白后，小鼠泛素化水平却降低[42]。因此，蛋白酶体抑制和泛素化之间的因果关系尚未确定，脑缺血后泛素化蛋白的富集是否为蛋白酶体损伤的直接结果有待进一步研究。

蛋白酶体抑制剂可在各种卒中模型中提供神经保护，如缺血后静脉、腹腔和产前注射蛋白酶体抑制剂MLN519、硼替佐米、CVT-634和BSc2118可导致神经保护[43]。但这些研究均未证实蛋白酶体抑制剂对脑蛋白酶体活性的抑制作用，而且不清楚这些抑制剂能否跨越血-脑屏障。这些抑制剂可能通过一种脑独立的机制减轻缺血后的神经炎性反应和血-脑屏障的破坏来发挥作用[44]。因此，无法肯定蛋白酶体抑制剂发挥神经保护作用的途径。

6.3.2自噬：除蛋白酶体外，泛素化相关蛋白的清除也可以通过自噬来完成，自噬主要负责回收细胞器和大的细胞质结构，也可以消化更大的泛素化聚集体。缺血后自噬调控研究较少，关于脑缺血后自噬是受损还是激活的报道相互矛盾。一项研究表明，在体内和体外缺血后的再灌注过程中，自噬持续上调，再灌注过程中阻断自噬会增加梗死体积和细胞死亡[45]。相反，在另一项动物实验中，缺血后的自噬通量下降，尤其是在死亡神经细胞中[46]。因此，不能确定这是否与泛素化蛋白的早期增加有关。

缺血后蛋白泛素化在缺血区边缘神经细胞中迅速、短暂增加，且这种增加依赖于再灌注。鉴于泛素化对细胞稳态和应激反应的重要性，这种变化对神经细胞存活和功能的影响显著。针对癌症和神经退行性变性疾病的泛素化系统的治疗已有先例，此类干预措施也可能适用于卒中。然而，目前对脑缺血后泛素化是如何诱导、泛素化涉及的酶，以及泛素化对神经细胞和最终卒中结局的影响知之甚少。在探索调节泛素化以达到治疗目的前，有必要更好地了解泛素在缺血性卒中中的作用。