保健食品中微量酚酞ELISA的快速检测方法

杨文斌，李晓娜，管淑玉, *

1. 广东药科大学中药学院（广州 511400）；2. 国家中医药管理局中药数字化质量评价技术重点研究室（广州 511400）

近年来，在保健食品中非法添加化学药物及化学成分越来越复杂与隐蔽，这给消费者带来极大的安全隐患和危害，也给监管部门带来监管困难与挑战。2018年国家食品药品监督管理总局（CFDA）公布的10起保健食品欺诈和虚假宣传典型案例中，就有2起案件是关于减肥类保健食品非法添加酚酞与盐酸西布曲明[1]。酚酞是化学品和临床处方药，主要用于治疗习惯性、顽固性便秘。过量或长期滥用，可造成人体电解质代谢紊乱，严重时甚至可诱发心律失常，是国家明令禁止非法添加的非食用物质[2]。一些不法商贩为达到快速减肥的效果，在保健食品中非法添加酚酞。因此，针对减肥类保健食品中非法添加酚酞的情况，建立一种快速、稳定、灵敏的检测方法，具有重要意义。

目前，用于检出非法添加酚酞的方法主要有拉曼光谱法、HPLC-DAD法、HPLC-MS/MS法等[3]。这些方法检测仪器昂贵、操作繁琐、专属性低。而免疫分析方法，尤其是ELISA，技术操作简单快速、灵敏度高、不需要昂贵的仪器设备等优点。逐渐成为市场上检测化合物有效手段之一。

传统间接竞争ELISA检测方法中，小分子半抗原与蛋白偶联后通过疏水作用吸附在酶标板上，而这种吸附作用会影响抗原与抗体的结合反应[4-5]。小分子半抗原与蛋白偶联的过程繁琐，重复性较差，不利于检测方法的标准化。该方法将酚酞氨基化后通过戊二醛直接交联于酶标板微孔上，避免传统ELISA检测的缺点。对其主要影响因素如包被浓度、封闭条件、抗体稀释度等进行优化，建立一种新型的检测酚酞ELISA方法。

1 材料

1.1 仪器与试剂

酶标仪（ELX800，BioTek Instruments）；低温高速离心机（北京博劢行公司）；恒温磁力搅拌器（JB-3，常州澳华公司）；AVANCE 500 MHz核磁共振仪（瑞士布鲁克拜厄斯宾有限公司）。

脱脂奶粉（北京Solarbio公司，批号232100）；卵清蛋白（OVA，合肥博美生物科技公司，批号AL7514）；辣根过氧化物酶（HRP，标记的羊抗鼠IgG，北京Solarbio公司，批号20180607）；96孔可拆卸酶标板（上海斯信生物科技有限公司，批号171224-079）；酚酞（天津大茂，批号20160917）；浓硝酸（广州化学试剂厂，20080601-1）；氨基乙酸（天津福晨化学试剂，20150205）免疫抗原（广东工业大学制备，批号PHCB170302）；酚酞多克隆抗体血清（自制）；50%戊二醛（麦克林公司，批号M00318013）；连二亚硫酸钠（天津永大化学试剂，20170804）；3, 3’, 5, 5’-四甲基联苯胺（北京Solarbio公司，批号0759）。

1.2 溶液的配置

pH 7.4磷酸盐缓冲液（PBS）：0.60 g NaH2PO4·2H2O和5.816 g Na2HPO4·12H2O，用蒸馏水定容至1 L；pH 9.6碳酸盐缓冲液：1.59 g Na2CO3和2.93 g NaHCO3，蒸馏水定容至1 L；酶标二抗稀释液及洗涤液（PBST）：含0.05%吐温-20的磷酸盐缓冲液；TMB显色液：10 mg TMB+1 mL H2O+10 μL 30% H2O2配成显色剂，取100 μL显色剂加入至9.9 mL底物缓冲液（蒸馏水溶解0.51 g柠檬酸和1.84 g Na2HPO4·12H2O并定容至100 mL）中混匀即为TMB显色液；终止液为2 mol/L浓硫酸。

2 方法与结果

2.1 氨基化酚酞的制备

称取1 g酚酞溶解于20 mL丙酮并置于100 mL单口瓶中，加入1 mL浓硝酸，不停搅拌，将体系升温至60℃，搅拌反应12 h。反应结束后，将20 mL水滴入到反应液中，析出大量黄色晶体，经过滤、用少许冷乙醇洗涤，烘干，过滤得到黄色固体a[6]。向100 mL三口瓶中加入0.5 g 3, 3’-二硝基酚酞、0.25 g无水碳酸钠，向瓶中加入20 mL DMF、10 mL去离子水，快速搅拌溶解。在60～70 ℃温度下，分批量加入1.5 g连二亚硫酸钠。溶液由红色逐渐变淡。加完料后升温回流1 h。冷却，过滤，用少量水冲洗残留的盐分，抽真空干燥得到灰白色固体b，合成路线见图1。

图1 氨基化酚酞的合成路线图

化合物b1H-NMR谱峰由AVANCE 500 MHz核磁共振仪测得，如图2所示。产物在δ=4.60时有一单峰，即为苯环氨基上的氢。δ=9.17时的峰为苯环上羟基氢。说明应用连二亚硫酸钠已经将苯环上硝基还原成氨基。

图2 化合物b 1H-NMR图谱

2.2 氨基化酚酞包被ELISA微孔板的制备

用pH 9.6碳酸盐缓冲液（CBS）将50%戊二醛稀释成6.5%，加入到酶标板中，每孔200 μL，37 ℃孵育2 h。PBST洗涤3次。用DMF溶解氨基化酚酞并用PBS稀释至4 μg/mL，加入酶标板中，每孔100 μL，37 ℃孵育2 h。PBST洗涤后，用适当浓度的氨基乙酸结合剩余的醛基部分，37 ℃孵育2 h。PBST洗涤3次后，加入5%脱脂奶粉，每孔200 μ L，进行封闭，37 ℃孵育2 h，用PBST洗涤5次后，冰箱4 ℃保存[3-4]。包被原理见图3。

图3 氨基化酚酞包被微孔板的过程

2.3 酚酞间接竞争ELISA（ic-ELISA）检测方法的研究

2.3.1 ic-ELISA检测的一般步骤

在制备好的微孔板中加入一定浓度样品及抗体，37 ℃孵育1 h。PBST洗涤5次，加入PBST稀释1 000倍后的酶标二抗，37 ℃孵育1 h，用PBST洗涤5次后，向酶标板中加入每孔100 μ L的TMB显色液，37 ℃孵育15 min后加入每孔50 μL 2 mol/L浓硫酸终止反应。用酶标仪450 nm波长测定OD值[7-8]。

2.3.2 封闭条件的优化

在包被氨基酚酞的酶标板上加入浓度分别为0.1，0.2，0.3，0.4和0.5 mol/L氨基乙酸，每孔200 μL。37 ℃孵育2 h后，5%脱脂奶粉37 ℃封闭2 h。PBST洗涤3次，加入PBS缓冲液，37 ℃孵育1 h，后续步骤同2.3.1。由图4可知，氨基乙酸浓度0.1 mol/L时，酶标二抗与酶标板微孔的非特异性结合最低，确定0.1 mol/L的氨基乙酸为最佳封闭浓度。

图4 封闭液的优化

2.3.3 抗体稀释液的筛选

为减少血清的非特异性结合，按上述最佳封闭条件，对戊二醛处理后的酶标板进行封闭。分别用1%卵清蛋白（OVA）、2.5%脱脂奶粉、PBST稀释抗体血清，按2.3.1的步骤测定OD450nm值。结果见图5，向抗体血清中加入一定量的脱脂奶粉可减少血清的非特异性结合，因此对脱脂奶粉浓度做进一步考察。用PBS配置含0，1%，2%，3%，4%和5%脱脂奶粉作为抗体的稀释液，在未包被氨基酚酞的酶标板中进行间接ELISA检测，结果见图6。3%脱脂奶粉抗体稀释液，有利于避免抗体血清的非特异性结合。

图5 抗体稀释液的选择

图6 脱脂奶粉浓度的筛选

2.3.4 最佳包被抗原及抗体稀释度的确定

采用方阵滴定法确定包被抗原浓度、抗体稀释倍数。包被原氨基化酚酞质量浓度为2，3，4，5和6 μ g/mL。抗体血清由1︰50倍比稀释至1︰1 600。采用间接非竞争ELISA测定OD450nm值。通过间接非竞争ELISA确定最佳包被浓度及抗体的稀释倍数，检测结果见表1。为确保检测结果的准确性及方便分析，一般选取OD450nm值1左右。ic-ELISA检测时血清的量为50 μL，因此选OD450nm值2.0左右。由表1可知，氨基酚酞质量浓度4 μ g/mL、抗体血清稀释倍数1︰100时，OD450nm=2.017，即包被抗原的最佳质量浓度4 μg/mL，抗体的最佳稀释倍数1︰100。

表1 方阵滴定法确定工作浓度

2.3.5 样品溶剂筛选及TMB显色时间的优化

将酚酞分别溶解于二甲基亚砜（DMSO）、二甲基甲酰胺（DMF）、甲醇、乙醇试剂中，配置成50 ng/mL的溶液。在未包被氨基酚酞的酶标板中加入样品与多克隆抗体，同2.3.1的步骤测定OD450nm值。发现DMSO、DMF可破坏封闭液，导致抗体的非特异性结合增加，而甲醇与乙醇影响较小，因此首选乙醇作为样品的溶剂。

2.3.6 ic-ELISA标准曲线的绘制

配置0.1，1，10，100，1 000和10 000 ng/mL酚酞标准品溶液，由确定的各因素最佳值进行间接竞争ELISA检测，按2.3.1的步骤测定OD450nm值。以酚酞标准品的浓度作为横坐标，B/B0值作为纵坐标构建ic-ELISA曲线。如图7所示。酚酞质量浓度在10～1 000 ng/mL区间线性较好。分别测定质量浓度为10，50，100，200，400，800和1 000 ng/mL酚酞标准品的吸光度，以酚酞浓度的对数值作为横坐标，以抑制率作为横坐标得到标准曲线（图8）。拟合标准曲线得到方程为y=38.795x-22.554，R2=0.980 2，检测范围IC20～IC80为（12.50～439.93 ng/mL）酚酞的IC50=74.15 ng/mL。说明酚酞多克隆抗体灵敏度较高。

图7 ic-ELISA标准曲线点的确定

图8 酚酞抗体血清抑制率标准曲线

2.3.7 精密度试验

酚酞标准品溶液质量浓度为30，150和300 ng/mL。按照2.3.6建立的ic-ELISA方法进行检测，每个浓度设4个平行孔进行精密度检测。得到该方法的精密度RSD，为4.5%～9.3%。结果见表2。

表2 不同质量浓度酚酞溶液的检测精密度（n=4）

2.3.8 加标回收率

配制质量浓度为30，150和300 ng/mL酚酞标准品溶液。按照2.3.6建立的ic-ELISA方法进行检测。计算酚酞的加标回收率及变异系数RSD。由表3可知，在标准曲线范围内，加入30，150和300 ng/mL的酚酞标准液，每个浓度测定3次。测定的平均回收率为89.76%，变异系数RSD=7.96%。说明在标准曲线范围内，该方法用于检测酚酞的含量具有准确性与重复性。

表3 不同质量浓度酚酞溶液的回收率测定结果（n=3）

3 讨论与结论

通过氨基化酚酞直接包被酶标板，建立酚酞含量检测标准曲线。该方法消除包被过程中，载体蛋白构象改变导致小分子半抗原与抗体结合力下降的因素，且不需要制备包被抗原。因此直接偶联ELISA更利于检测方法的标准化及检测的稳定性。为减少抗体血清的非特异性结合，用0.1 mol/L氨基乙酸结合微孔板上多余的醛基。对抗体稀释液进行优化，3%脱脂奶粉可有效避免抗体血清的非特异性结合。试验建立的酶联免疫方法与仪器检测方法相比操作更简便、费用更低，可快速测定大批量样品。在市场监督酚酞的非法添加中具有应用价值。