液-液微萃取结合气相色谱-质谱联用技术快速测定饮料酒中挥发性酚类化合物

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(1.中国贵州茅台酒厂(集团)有限责任公司，贵州仁怀 564501；2.贵州茅台酒股份有限公司，贵州仁怀 564501)

挥发性酚类化合物是饮料酒中的重要风味物质，其对于酒的闻香、口感以及稳定性等方面具有重要作用。有研究发现香草醛、4-乙基苯酚、愈创木酚、4-乙基愈创木酚、4-丙基愈创木酚在朗姆酒中的香气强度(OAV)≥1[1]；愈创木酚和香草醛是威士忌关键香气的组成成分[2 - 3]；葡萄酒中4-乙基苯酚、4-乙基愈创木酚两种酚类总浓度小于400μg/L时贡献辛香、烟熏香等，大于620μg/L时会给酒样带来“酚味”、“动物臭”、“马厩臭”等风味缺陷[4 - 5]。近年来，有学者发现受林火烟雾污染的葡萄会给酒体带来高浓度酚类物质，从而出现烟熏味、灰烬味以及烧焦味等缺陷风味[6]。酚类物质对中国白酒的风味影响同样倍受关注，近几年的研究认为4-甲基苯酚主要与浓香型白酒窖泥及白酒中异嗅有关，但相关研究还较少[7 - 8]。因此，快速、准确定性定量分析酒精类饮料中挥发性酚类化合物对风味研究具有重要意义。

目前，已报道的酒精类饮料中挥发性酚类化合物测定方法，主要是各种预处理方法与气相色谱或液相色谱联用，如浸入式固相微萃取(DI-SPME)[9]、搅拌棒吸附萃取(SBSE)[10]、液-液萃取(LLE)[11]、C18固相萃取[12]，结合气相色谱-质谱(GC-MS)法；LLE结合高效液相色谱(HPLC)分离，采用荧光检测器(FLD)或二极管阵列检测器(DAD)测定[13 - 14]。DI-SPME、SBSE方法操作简便，但存在竞争吸附，影响低含量酚类物质检测的灵敏度，HPLC主要适用于难挥发性酚类化合物分析，LLE及C18固相萃取的方法需要氮吹浓缩、洗脱等步骤，有机溶剂用量较大。液-液微萃取(LLME)作为一种预处理方式，具有萃取效率高、操作方便、仪器条件要求低、有机溶剂用量少等优点，但目前在酚类化合物分析方面的应用还未见报道。

本研究采用直接LLME，对萃取溶剂种类、用量、萃取酒精度、萃取pH等条件进行优化选择，最终有机相可直接进样分析，无需氮吹浓缩步骤，建立了一种准确、快速定性定量分析饮料酒中挥发性酚类化合物的方法。本方法对于酒精度大于10%vol的酒样先进行稀释降度，对于酒精度小于10%vol的饮料酒无需进行稀释。并使用该方法分析了市场上不同白酒及威士忌样品中的挥发性酚类化合物，结果表明，所测得9种挥发挥发性酚类化合物在不同类型酒精饮料中含量分布差异较大。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

AgilentGC7890A-5975MSD气相色谱-质谱联用仪；VORTEX-GENIE2涡旋振荡器；梅特勒公司MS1602TS分析天平；艾科普AFX-2002-U超纯水纯化系统。

标准品：苯酚(Phenol)、4-甲基苯酚(4-Methylphenol)、4-乙基苯酚(4-Ethylphenol)、愈创木酚(Guaiacol)、4-甲基愈创木酚(4-Methylguaiacol)、4-乙基愈创木酚(4-Ethylguaiacol)、4-乙烯基愈创木酚(4-Vinylguaiacol)、香草醛(Vanillin)、香草酸乙酯(Vanilicacidethylester)、3,4-二甲基苯酚(3,4-Dimethylphenol，内标)，纯度均大于99%，均购自美国Sigma-Aldrich公司。标准溶液及内标溶液配制：分别准确称取适量标准品，用乙醇配成浓度约为10000mg/L标准品储备溶液，置于4℃冰箱中保存待用。乙醚(分析纯，上海国药集团化学试剂有限公司)；戊烷(色谱纯，美国天地公司)，重蒸后使用；NaCl(分析纯，上海国药集团化学试剂有限公司)；乙醇(色谱纯，纯度99.9%，ACS公司)。水为超纯水。

酒样：市售酱香型白酒、浓香型白酒、清香型白酒、威士忌。

1.2 实验方法

1.2.1样品预处理准确吸取5 mL酒样于40 mL样品瓶中，加超纯水稀释酒精度至10% vol，再加入8.5 g NaCl进行饱和，加入2 μL 3,4-二甲基苯酚溶液作为内标，然后加入萃取剂，涡旋振荡1 min，静置分层，吸取上层有机相进行气相色谱-质谱分析。

1.2.2仪器条件气相色谱条件：DB-FFAP毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，进样口温度为230 ℃，载气为氦气，流速1.3 mL/min，进样量为1 μL，不分流进样；升温程序：40 ℃，不保持；1 ℃/min升至50 ℃；5 ℃/min升至220 ℃，保持10 min。质谱条件：离子源(EI)，电子轰击能量为70 eV，离子源温度230 ℃，四极杆温度150 ℃，采集模式为全扫描模式(SCAN)及选择离子监测模式(SIM)，SCAN用于定性，SIM用于定量。定量离子的选择兼顾每种化合物碎片离子的特异性及丰度，排除干扰的同时提高灵敏度，详细参数见表1，检索谱库为NIST 14a.L。

表1 选择离子监测模式条件

1.2.3定性与定量分析采用SIM的方法对9种酚类化合物进行积分，以标准品与内标峰面积之比为横坐标(x)，标准品浓度与内标浓度之比为纵坐标(y)，绘制标准曲线。以3,4-二甲基苯酚为内标通过标准曲线进行定量分析。以53%乙醇-水溶液为基质，将9种待测酚类物质标准品配制成混合标准储备溶液，采用两倍稀释法得到一系列不同浓度的标准溶液。将待测样品按照1.2.1方法进行预处理后，吸取上层有机相进样分析，按照标准曲线计算样品中待测物浓度。

2 结果与讨论

2.1 液-液微萃取方法的建立

图1 萃取溶剂的选择Fig.1 Selection of extraction solvent

2.1.1萃取溶剂的选择由于待测酚类化合物种类较多，选择的萃取溶剂需兼顾多种酚类的萃取效果。乙醚与戊烷是白酒分析常用、且效果较好的极性与非极性萃取溶剂，实验比较了乙醚、戊烷、乙醚-戊烷(体积比1∶1)分别为萃取溶剂时酚类化合物的萃取效果(图1)，以能够检测到的酚类化合物种类及总峰面积为考量指标。结果表明，采用乙醚为萃取溶剂时，酚类化合物萃取效果最佳，乙醚与酚类化合物同属极性化合物，戊烷为非极性溶剂，根据相似相溶原理，乙醚萃取效果优于戊烷，实验结果与之相符，选择乙醚作为萃取溶剂。

2.1.2萃取溶剂用量及萃取级数的选择酚类化合物在白酒中为微量成分，因此酒样用量不宜过少，同时考虑方法的操作便捷性，选择酒样用量为5 mL，在满足萃取效率及操作便捷性的同时，减少萃取剂用量可省去氮吹浓缩步骤，且环保性好。当有机溶剂为1 mL时，吸取上层有机相较困难，因此选择萃取溶剂用量为2 mL。为保证萃取效率，实验考察了多级萃取的效果，以乙醚为萃取剂，每次加入2 mL，共萃取3次。结果显示：除愈创木酚及香草醛一次萃取效率略低于90%，其余7种酚类物质一次萃取效率均在90%以上，总酚类的萃取效率也在90%以上(图2)，第三级萃取峰面积相对前两次可忽略不计(<3%)。因此方法选择2 mL萃取溶剂萃取一次。

2.1.3萃取酒精度的选择由于酒精度影响萃取效果，实验采用加水稀释的方法降低样品的酒精度，分别比较了在5% vol、10% vol、15% vol、20% vol 4种酒精度条件下能够检测到的酚类化合物种类数及总峰面积(图3)。结果显示，低的酒精度利于酚类物质的萃取，酒精度过高时，目标物萃取分离效果差，随着酒精度的降低，酚类物质响应及种类呈上升趋势，当酒精度为10% vol与5% vol时，能够检测到的酚类化合物种类相同，酚类总峰面积也基本相同，兼顾操作的便捷性及分析成本，实验选择萃取酒精度为10% vol。根据这一实验结果，我们也可以知道对于酒精度低于10% vol的饮料酒，可直接进行萃取，无需稀释步骤。

图2 萃取级数的选择Fig.2 Selection of extraction frequency

图3 酒精度的选择Fig.3 Selection of alcohol concentration

图4 萃取pH的选择Fig.4 Selection of pH

2.1.4萃取pH条件的选择酚类物质带有酚羟基，一般呈弱酸性，但白酒中同时含有丰富的有机酸，与酚类物质性质相近，且酚类物质与高级脂肪酸酯出峰时间相近，这些都会对酚类物质分析造成干扰，因此实验通过调整不同的pH以期减少有机酸的干扰，提高酚类物质萃取效率。实验采用10%NaHCO3溶液及0.1 mol/L H2SO4对加水稀释后的酒样pH进行调节。实验分别比较了pH为1、3、5及7时酚类的萃取效果(图4)，其中pH=3为不进行调节时酒样的原始pH。结果表明，pH=3时，9种酚类的萃取效果均最佳。当pH为5、7时，虽然可适当减小有机酸的影响，但酚羟基可能也被部分中和，因此选择萃取pH条件为3，即不进行pH调节。

图5 9种酚类化合物的总离子流(TIC)色谱图Fig.5 TIC chromatogram of 9 phenol compounds1.Guaiacol;2.4-Methylguaiacol;3.Phenol;4.4-ethylguaiacol;5.4-Methylphenol;6.4-Ethylphenol;7.4-Vinylguaiacol;8.3,4-Dimethylphenol;9.Vanillin;10.Vanilicacidethylester.

综上，优化条件下，9种酚类物质混合标准溶液的SIM总离子流色谱图如图5，可以看出9种酚类物质均具有较好的峰形，且能达到良好的分离效果。

2.2 方法评价

2.2.1线性范围、检出限与定量限按照1.2.3方法绘制标准曲线，9种挥发性酚类化合物在一定浓度范围内均呈现良好的线性关系(R2≥0.997)。按3倍和10倍信噪比计算得到9种酚类化合物的检出限(S/N≥3)及定量限(S/N≥10)，用标准工作曲线对待测样品中待测组分进行内标法定量，样品的响应值应在标准工作曲线的线性范围内，结果见表2。

2.2.2回收率与精密度本方法采用加入回收试验进行准确度和精密度的评价。以酚类化合物含量较低的酒样为基质，分别按照高、中、低3个浓度水平进行加标回收率测定，每个水平做6个平行，各化合物回收率及精密度见表3。结果表明：9种酚类化合物不同浓度的添加回收率为88.3%～108.6%，相对标准偏差(RSD)为0.6%～6.4%。本方法的准确度和精密度均符合有关标准和法规的要求。

表2 9种酚类化合物的线性范围、线性关系、检出限(LODs)及定量限(LOQs)

表3 9种酚类化合物的加标回收率及相对标准偏差(RSDs)(n=6)

(续表3)

CompoundSpiked(μg/L)Background(μg/L)Recovery(%)RSD(%)196.891.35.6106.0103.16.4Vanilicacidethylester28.111.288.10.718.789.92.29.35103.90.8

2.3 实际样品的测定

应用本方法对市售不同香型白酒样品以及威士忌样品进行分析，其中酱香型白酒样品(Maotai-flavor liquor)30个、浓香型白酒样品(Luzhou-flavor liquor)28个、清香型白酒样品(Fen-flavor liquor)6个、威士忌样品(Whiskey)5个，共计69个样品，结果见表4。

表4 市售样品中挥发性酚类化合物

从表4可知，不同饮料酒中酚类化合物种类、含量间存在显著差异，9种挥发性酚类物质在清香型白酒及威士忌中均有检出，但含量存在差异。苯酚、4-甲基苯酚存在于所有酱香型、浓香型、清香型及威士忌样品中，从含量上讲，这两种酚类为酒精饮料中最主要的两种酚类化合物。苯酚、4-甲基苯酚及4-乙基苯酚在浓香型白酒中含量明显高于清香型及酱香型白酒，尤其4-甲基苯酚，可能与浓香型白酒所用窖泥及其工艺特点有关。酱香型白酒中愈创木酚含量与威士忌基本持平，含量范围0～399.0 μg/L，高于浓香型白酒(0～41.7 μg/L)与清香型白酒(30.6～60.1 μg/L)，而张灿[8]采用的检测方法在酱香型白酒中均未检出愈创木酚、4-甲基愈创木酚、4-乙基愈创木酚、4-乙烯基愈创木酚，说明本文方法灵敏度更高。威士忌中4-乙烯基愈创木酚、香草醛及香草酸乙酯含量范围分别为129.0～212.9 μg/L，1154.2～2180.3 μg/L和131.1～279.2 μg/L，含量明显高于其它几种酒类，这与其储存容器橡木桶有关[15]。

3 结论

本研究采用液-液微萃取结合气相色谱-质谱联用技术，建立了一种快速、准确定性定量分析白酒中酚类物质的方法。采用该方法检测了64种市售不同香型中国白酒以及5种威士忌样品，结果表明，该方法在白酒及威士忌样品中均适用，所测9种酚类物质在不同类型酒精饮料中含量分布差异较大。浓香型白酒中苯酚、4-甲基苯酚及4-乙基苯酚含量较高，威士忌中4-乙烯基愈创木酚、香草醛及香草酸乙酯含量明显高于其它几种酒类。本方法可为酒精类饮料中酚类物质的研究提供方法参考。