人血浆N-糖链超高效液相色谱检测方法的优化

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(南京农业大学食品科技学院，江苏南京 210095)

人体血浆N-糖链结构和含量会因人体健康状况而异，因此血浆中N-糖链成为临床上诊断和监测多种疾病发生和发展的新的重要标志物。研究表明，N-糖链结构和含量的改变与疾病，例如炎症反应和癌症等密切相关[1 - 3]。人血浆中的N-糖链结构具有多样性，以复杂型N-糖链为主，也含有少量高甘露糖型和杂合型糖链。人血浆样品中的N-糖链富含末端唾液酸修饰。但唾液酸的性质不稳定，容易在酸碱条件下解离[4]。

目前除了直接使用质谱分析，国内外糖蛋白N-糖链的分析多采用液相色谱对糖链进行分离，然后使用在线或离线质谱对分离的同分异构体进行结构分析，因此灵敏度和分辨率更高的高效液相色谱技术越来越普遍的应用于N-糖链的分析中[5 - 7]。常用的N-糖链的分析主要由样品前处理、酶法或化学法糖链释放、糖链荧光标记及高效液相色谱检测等部分组成[8]。Barbara等[9]对人血浆中纤维蛋白原的N-连接糖链的分析中，使用聚丙烯酰胺凝胶电泳对纤维蛋白进行分离纯化，直接使用N-糖酰胺酶F(PNGaseF)释放糖链后，采用超高效液相色谱(UPLC)进行分析。Wang等[10]在有关牛乳和人乳蛋白结合N-连接寡糖抗病原体活性的研究中，采取三氯乙酸(TCA)对蛋白质进行沉淀并洗涤去除游离糖之后进行液相色谱分析。本实验选取N-糖链检测方法的三个步骤，包括样品前处理方法、标记时间和进样浓度，对N-糖链的亲水性高效液相色谱分析方法进行了优化，并用于人血浆样品中N-糖链分析。该方法日内和日间重复性无显著差异，适用于富含唾液酸的人血浆样品的检测。

1 实验部分

1.1 仪器及试剂

UltrafileXtremeMALDI-TOF质谱仪(德国，Bruker公司)；LC-30AD超高效液相色谱仪(日本，Shimadzu)，配RF-20Axs荧光检测器。

2,5-二羟基苯甲酸(DHB)、2-氨基苯甲酸胺(2-AB)、SupelcleanTMENVI-CarbTM预装碳柱均购自美国西格玛公司。唾液酸酶(GlykoTMSialidaseA)购自Prozyme公司。N-糖酰胺酶F(PNGaseF)由本实验室表达纯化。乙腈、甲酸、氨水均为色谱纯，购自默克公司。其他试剂均为分析纯。实验用水为去离子水。

人血浆采集自健康自愿者。

1.2 实验方法

1.2.1血浆样品前处理直接加热变性法：取200 μL血浆，加入128 μL去离子水，23 μL 500 mmol/L磷酸盐缓冲液(pH=7.5)，12.5 μL变性剂(2%SDS水溶液，7%β-巯基乙醇)，95 ℃加热变性10 min。三氯乙酸(TCA)沉淀法：取200 μL 40%TCA溶液与200 μL血浆混合，12 500 r/min离心30 min，移去上清液，加入1 mL去离子水，振荡重悬，离心并弃去上清液，重复操作洗涤沉淀5次。氯仿/甲醇沉淀法：200 μL血浆加入氯仿/甲醇(体积比1∶2∶1)，振荡混匀，12 500 r/min离心20 min后，取中间层固体，加入1 mL 去离子水，振荡重悬，离心并弃去上清液，重复操作洗涤沉淀5次。

1.2.2N-糖酰胺酶F消化释放糖链直接加热变性样品，加入50 μL PNGase F与19 μL 10%Triton X-100水溶液，37 ℃消化过夜。TCA沉淀法和氯仿/甲醇沉淀法所得固体沉淀，加入200 μL去离子水振荡重悬，再加入128 μL去离子水、23 μL 500 mmol/L磷酸盐缓冲液(pH=7.5)、12.5 μL变性剂(2%SDS水溶液，7%β-巯基乙醇)，50 μL PNGase F与19 μL 10% Triton X-100水溶液，37 ℃消化过夜。

1.2.3N-糖链的纯化和荧光标记N-糖酰胺酶F消化样品，12 500 r/min离心20 min，取上清液加入活化的SupelcleanTMENVI-CarbTM预装碳柱，滴净；加入3 mL去离子水，滴净；再依次加入1.5 mL 20%乙腈和1.5 mL 40%乙腈，分别收集，合并洗脱液，使用真空离心旋干机旋干样品。干燥样品中加入10 μL的2-AB标记液(35 mmol/L 2-AB、0.1 mol/L氰基硼氢化钠溶于DMSO-冰HAc混合溶液(体积比7∶3)，充分混合)，65 ℃金属浴反应4 h。反应产物中加入40 μL去离子水稀释,待用。

1.2.4荧光标记糖链的超高效液相色谱(UPLC)检测10 μL稀释的2-AB标记产物加入40 μL不同浓度的乙腈水溶液，使乙腈终浓度(体积分数)分别为20%、40%、60%和80%，12 500 r/min离心2 min，取40 μL上清液用于UPLC分析。色谱条件为：Acquity BEH糖化柱(150×2.1 mm，1.7 μm；Waters)，柱温60 ℃；流速为0.5 mL/min；进样量为40 μL；流动相A为50 mmol/L甲酸铵缓冲液(pH=4.5)，流动相B为乙腈；荧光检测器波长为Ex/Em=330/420 nm；洗脱程序：0～6 min，流动相A由5%线性升至12%；6～45 min，流动相A比例进一步线性提升至44%；46～49 min，流动相A提升为100%并维持1 min；51～58 min，流动相A比例降至5%并维持7 min。

1.2.5唾液酸酶处理10 μL稀释的2-AB标记产物加入1 μL GlykoTMSialidase A，5 μL去离子水，4 μL 酶切缓冲液，37 ℃消化过夜。酶切产物采取1.2.4所述液相色谱方法进行检测。

1.2.6基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)分析根据UPLC谱图，对色谱各峰进行收集，使用真空离心干燥机旋干。旋干的样品中加入3 μL去离子水，充分混匀，取出1 μL，与1 μL DHB基质混匀，点样于板上，风干后，质谱检测。以马心肌肌红蛋白的胰蛋白酶酶解肽段为标准品进行校正。正离子模式质谱条件为：离子加速电压20 kV，质荷比扫描范围m/z800～3 000，采集数据所用激光的能量为6 000。负离子模式的条件为：离子加速电压20 kV，质荷比扫描范围m/z2 000～4 000，采集数据所用激光的能量为6 000。由总激光发射脉冲次数为3 000的质谱图累加而得到所需的质谱图。采用Bruker Flexanalysis 3.3分析软件对质谱数据进行处理，并使用GlycoWorkbench糖结构分析软件对质谱结果进行推导。

2 结果与讨论

2.1 血浆样品蛋白结合N-糖链检测方法的优化

2.1.1样品处理方法的优化在样品前处理阶段，本实试验比较了常用的三种样品处理方法，其中TCA沉淀法采用了酸性溶液，氯仿/甲醇沉淀法使用了有机溶剂，直接加热法涉及高温条件[11 - 12]。如图1A所示，与TCA沉淀法和氯仿/甲醇沉淀法相比，直接加热法在保留时间28 min以后的各色谱峰面积所占比例明显高于另外两种前处理方法，尤其是保留时间为28.2、34.3和35.6 min的色谱峰。后续对各色谱峰所含N-糖链的结构分析显示，28 min以前的各色谱峰主要以中性糖为主，而28 min以后各峰含有大量具有唾液酸修饰的N-糖链。推断TCA或者有机溶剂处理可能会引起部分唾液酸的解离，从而导致UPLC检测时含唾液酸的色谱峰面积所占比例下降。而直接加热处理处理时间较短，且pH值近中性，并未引起唾液酸的剧烈剥离。此外，与另外两种操作相比直接加热法流程更加简单，减少了蛋白样品的损失和糖链的降解。后续实验选取直接加热法处理血浆样品。

2.1.2荧光标记时间25 μL血浆样品经直接加热变性前处理后使用PNGase F消化，使得N-糖链从蛋白上解离下来。释放的N-糖链再经过固相萃取碳柱的纯化，去除蛋白和盐。旋干后，N-糖链使用荧光标记物2-AB进行标记。实验对不同的标记反应时间进行了比较，所得色谱图见图1B。不同标记时间的色谱图，色谱峰的个数、保留时间基本一致，并且随着标记时间的延长，各色谱峰的峰高和峰面积均不同程度增加。但对各色谱峰峰面积所占比例的分析发现，标记4 h以后，28 min以后各峰峰面积所占比例开始下降，即富含唾液酸的色谱峰面积所占比例下降。这可能是由于2-AB反应是在酸性加热条件下进行，且随标记时间的延长而脱唾液酸现象加剧。本实验选择荧光标记4 h。

2.1.3进样浓度的选择实验进一步考察了进样浓度对N-糖链液相色谱检测的影响。通过与不同浓度乙腈混合，使得荧光标记N-糖链的乙腈进样终浓度分别为20%、40%、60%和80%。从图1C可见，使用20%和40%的乙腈浓度进样，样品色谱图的基线具有明显的波动和漂移，各色谱峰前延，影响检测效果。60%的乙腈浓度进样条件下，色谱图基线平稳，色谱峰对称，并且无任何色谱峰丢失情况。而使用80%的乙腈浓度进样，保留时间在28 min以后的色谱峰峰高显著降低，甚至完全消失。后续N-糖链结构分析结果提示这些色谱峰中含有大量末端唾液酸修饰的酸性N-糖链。高乙腈进样浓度对液相色谱检测的影响，可能是由于末端具有唾液酸修饰的酸性N-糖链在此条件下溶解度较小，随着离心过程中析出，最终导致样品检测中28 min以后的N-糖链的色谱峰丢失。而保留时间28 min以前色谱峰未见明显改变，可以推测乙腈进样浓度对聚合度较低的中性糖影响较小，这也与以往对植物N-糖组的研究所观察到的现象类似，由于植物N-糖链缺乏唾液酸修饰，因此80%的乙腈进样浓度对植物N-糖组的检测并无明显影响[13]。综合考虑本实验选择60%作为优化的乙腈进样浓度。

图1 不同优化方法处理人血浆所得蛋白结合N-糖链的UPLC谱图比较Fig.1 Comparison of chromatograms of N-glycans on glycoproteins from human plasma under different procedures(A) Pretreatment;(B) Labeling time;(C) Acetonitrile concentration.

最后确定的分析方法为：对血浆样品进行直接加热法前处理、PNGase F释放糖链，经固相萃取柱纯化后采用2-AB进行标记，标记时间4 h，标记产物使用60%乙腈浓度进样，UPLC法检测。

2.2 人血浆N-糖链UPLC检测和结构分析

图2 人血浆N-糖链UPLC谱图及唾液酸酶消化后的N-糖链UPLC谱图Fig.2 UPLC profile of human plasma N-glycans and product of sialidase digestion

2.2.1人血浆N-糖链UPLC检测和唾液酸酶消化分析人血浆N-糖链色谱图如图2所示。共检测到色谱峰19个，其保留时间和相对含量分别为20.8 min(2.49%)、21.7 min(0.92%)、22.1 min(0.35%)、23.6 min(2.89%)、24.1 min(1.59%)、25.0 min(1.77%)、25.4 min(1.03%)、26.7 min(4.66%)、27.5 min(0.53%)、28.2 min(15.94%)、29.4 min(7.66%)、30.6 min(40.48%)、31.6 min(3.96%)、32.1 min(1.58%)、32.4 min(1.03%)、33.5 min(3.64%)、34.3 min(4.20%)、35.6 min(4.83%)、36.2 min(0.45%)。经过唾液酸酶处理去除末端唾液酸修饰后，血浆样品中N-糖链的谱图发生了明显改变：保留时间为28.2、30.6、32.1、32.4、34.3、35.6 min的谱峰响应值发生了明显的降低，而25.4、26.7、27.5 min 的谱峰响应值升高。推断28 min后的绝大部分色谱峰所含N-糖链均具有末端唾液酸修饰。而酶处理后，保留时间为25.8、26.7、27.5 min的色谱峰响应值增高，可能是由于唾液酸酶的消化作用使得相应无唾液酸N-糖结构的含量上升。

2.2.2人血浆N-糖链的葡萄糖单位值计算为了进一步分析人血浆中N-糖链的结构，本实验对色谱分离所得各色谱峰的葡萄糖单位(GU)进行了计算，通过与已有数据库进行比较和质谱分析结果互相验证，从而推测各峰所含N-糖链的可能结构。在对人血浆样品进行UPLC检测的同时检测2-AB标记的葡聚糖标准品(聚合度2～20)。根据UPLC谱图中不同聚合度的葡聚糖的保留时间，计算人血浆样所含19个峰的GU值分别为5.93、6.11、6.28、6.65、6.85、6.99、7.14、7.48、7.67、7.95、8.22、8.60、8.83、9.11、9.17、9.52、9.98、10.19和10.47。使用GU值为各峰命名，并依据图中标示进行收集，旋干后使用MALDI-TOF MS对各峰进行检测。

2.2.3人血浆N-糖链的质谱分析根据正离子模式下各色谱峰的一级质谱图，共检测到11个[M+Na]+离子峰符合2-AB标记N-糖链的理论荷质比，分别为：m/z1606.25、m/z1377.59、m/z1808.76、m/z1767.98、m/z1767.76、m/z1539.66和m/z1970.91、m/z1783.76、m/z1929.55、m/z2132.65和m/z2025.77。与检测到的[M+Na]+离子峰对应的N-糖链具体结构见表1。

根据负离子模式下各色谱峰的一级质谱图，共检测到29个离子峰符合2-AB标记N-糖链的理论荷质比。其中25个[M-H]-离子峰分别为：m/z1888.88、m/z1847.56、2033.63和2050.63、m/z2032.80以及2237.89、m/z2050.74、m/z2197.11、m/z2341.88和2399.95、m/z2196.92、2416.00和2488.02、m/z2562.14 和2691.32、m/z2416.16、2475.14和2562.21、m/z2474.94、2562.10和2707.15、m/z2999.03、m/z2781.20和m/z2839.38、2927.39。另外还检测到m/z2766.00的[M+Na+K-3H]-离子峰，m/z3036.18 和3182.29的[M+K-2H]-离子峰，以及m/z3400.49的[M+K-2H]-离子峰。与检测到的离子峰相对应的N-糖链具体结构见表1。

此外还检测到m/z2050.79的[M-H]-离子峰，可能为N-糖链2-AB-A2G2S(3)2在质谱检测过程中脱去一个唾液酸导致。检测到m/z2416.03[M-H]-的值，符合2AB-Hex6HexNAc5Neu5Ac(m/z2415.88[M-H]-)的理论值，但与2-AB-A3G3S(3)和2-AB-A3G3S(6)的GU值均不相符，可能为色谱峰9.17的污染。检测到m/z2707.33 [M-H]-的值，符合2AB-Hex6HexNAc5Neu5Ac2(m/z2706.98[M-H]-)的理论质荷比，但与2-AB-A3G3S(3)2的GU值不符，可能为色谱峰9.52的污染。检测到m/z2416.11 [M-H]-(2-AB-A3G3S)的值,可能为N-糖链2-AB-A3G3S(3)2在质谱检测过程中脱去一个唾液酸所得。检测到m/z2475.81的值，与2AB-Hex6HexNAc6Fuc(m/z2473.92 [M-H]-)的理论质荷比相似，但其GU值不符合2-AB修饰的N-糖链2-AB-A4G3F和2-AB-FA4G3，可能是2-AB-FA4G3S在质谱检测时脱唾液酸的产物。

根据质谱数据、GU值及已知N-糖链数据，共推测出人血浆中N-糖链结构40种，见表1。其中包含高甘露糖型的N-糖链3种(M5、M6和M9)，杂合型N-糖链1种(M4A1G1S)，其余均为复杂型N-糖链。复杂型N-糖链中二天线型共19种，三天线型12种，四天线型5种，具有核心α1，6岩藻糖修饰的共20种，具有中分型乙酰氨基葡萄糖修饰的6种，具有末端唾液酸修饰的26种。根据带电荷的情况，共检出中性N-糖链13种，主要分布在保留时间28 min以前，酸性N-糖链即具有唾液酸修饰的N-糖链共有27个，主要分布在保留时间25 min以后，尤其是保留时间30 min以后的大部分N-糖链都具有至少两个唾液酸修饰。由此可见，根据GU值和质谱数据解析的糖链结构与之前唾液酸酶消化的结果相一致。文献报道[14 - 15]通过此方法检测到人血浆中的N-糖链结构种类与相对含量与相关文献报道基本一致[4]。人血浆蛋白结合N-糖链主要以复杂型N-糖链为主，此外还含有微量的高甘露糖型和杂合型糖链。复杂型N-糖链种类包括二天线、三天线、四天线复杂型N-糖链，其中二天线型N-糖链占总糖链的30%以上。复杂型N-糖链常具有核心α1，6岩藻糖修饰和/或末端唾液酸修饰和/或中分型乙酰氨基葡萄糖修饰，其中大部分复杂型N-糖链都含有末端唾液酸修饰。

表1 根据UPLC和MALDI-TOF MS数据推测的人血浆蛋白结合N-糖链

Note:A:GlcNAc;B:Bisecting GlcNAc;G:galactose;M:maltose;F:fucose;S(3):α2,3 sialic acid;S(6):α2,6 sialic acid.

2.3 血浆样品蛋白结合N-糖链分析方法的验证

为了验证血浆样品蛋白结合N-糖链分析方法，分别对样品检测限和重复性进行了考察。由图3A所示，比较血浆用量从1.25 μL到200 μL的检测结果。根据色谱图，当血浆用量为200 μL时，色谱峰8.60超出了仪器的检测上限；而1.25 μL的样品除色谱峰7.95和8.60以外，其余色谱峰的峰高均不足基线噪音的3倍，因此该方法的检测限为2.5 μL血浆用量。当血浆用量5 μL时，各峰峰高均达到基线噪音的10倍以上，因此该方法定量限为5 μL血浆用量。为了验证该方法的稳定性及重复性，采取连续3 d每天重复3次检测同一血浆样品，根据图3B显示，9个样品各色谱峰的峰面积占比无显著性差异，表明该N-糖链分析方法在时间、仪器误差允许的前提下，具有较好的稳定性以及重复性，为后期大规模微量样本的测定提供了基础。

3 结论

以往研究表明人血浆中富含唾液酸修饰的N-糖链，而唾液酸化学性质不稳定，尤其是在酸碱溶液中，高温处理会引起唾液酸结构的破坏[16]。本研究结合UPLC法、外切糖苷酶分析和离线MALDI-TOF MS数据，发现前处理方法、糖链荧光标记和液相色谱进样浓度是影响富含唾液酸修饰N-糖链检测的关键步骤，并进行了相应优化。此外实验还考察了优化后方法的检测限和重复性，证明其适合于微量人血浆样品的蛋白结合N-糖链分析检测。方法样品处理简便，重复性高，并能在现有条件下最高限度地保证血浆样品中含唾液酸N-糖链的完整性。