固相萃取-超高效液相色谱/串联质谱同时检测鸡蛋中的10种喹诺酮类药物残留

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(重庆市食品药品检验检测研究院，重庆渝北 400020)

喹诺酮类抗生素是一类人畜通用的药物，因其具有抗菌谱广、抗菌活性强及与其他抗菌药物无交叉耐药性等特点，被广泛应用于人和动物疾病的治疗。但近十几年来，滥用及超量使用抗生素类药物的现象普遍存在，喹诺酮类药物残留问题也越来越引起人们的关注[1]。联合国粮农组织/世界卫生组织食品添加剂专家联席委员会、欧盟都已制定了多种喹诺酮类药物在动物组织中的最高残留限量。我国农业部235公告明确规定了产蛋鸡中是禁止使用的[2],但为了追求高额利益，在养殖期间随意添加、不遵守休药期、违法滥用药物使得喹诺酮类药物在鸡蛋的残留问题越来越严重。因此，有必要建立一种快速、简便、准确、灵敏的分析方法来检测鸡蛋中的喹诺酮类药物残留。目前，喹诺酮药物类残留的分析方法主要有酶联免疫吸附分析法(ELISA)、高效液相色谱法(HPLC)和液相色谱-质谱分析法(LC-MS)[3 - 6]。前处理方面，大多数都是用磷酸盐缓冲溶液提取后加正己烷脱脂，或者用乙腈沉淀蛋白质和正己烷脱脂[7 - 9]。我国国家标准(GB/T20366-2006)和(GB/T21312-2007)推荐的检测方法中，前者需要大量提取液提取，经旋转蒸发浓缩后净化，耗时长，不适合大批量样品的日常检测；后者用缓冲盐溶液提取，再用传统的固像萃取小柱净化。但鸡蛋中含有大量脂类、氨基酸及蛋白质等干扰物，样品经缓冲盐溶液提取之后的提取液较浑浊，不利于净化，进而影响结果准确度。

本实验采用一种新型反相固相萃取watersOasisPRiMEHLB小柱净化。PRiMEHLB小柱是在水可浸润性填料HLB基础上进行的创新和设计，不需要活化、平衡，直接将基质干扰吸附在填料内，待测物过滤到收集瓶中，无需洗脱，简化了操作步骤，节省了前处理时间。David等[10 - 11]用PRiMEHLB固相萃取柱建立了牛奶中多种兽药同时检测的方法，能有效去除牛奶中大部分的基质干扰，同时回收率和精密度良好;李洪斌等[12 - 14]将PRiMEHLB用于兽药残留的净化也取得了很好的效果。目前鸡蛋中喹诺酮类药物残留研究的报道较多[15 - 18]，大多用传统方法提取，用高效液相色谱-荧光检测法测定，外标法定量，采用内标法的较少[19]。传统的提取方法存在提取效率的问题；外标法定量有很强的基质干扰；高效液相色谱法对于多种物质的检测难以解决分离问题。本文在前人的研究基础上，建立了新型固相萃取-超高效液相色谱/串联质谱(UPLC-MS/MS)测定，内标法定量，快速测定鸡蛋中的10种喹诺酮类药物残留的方法。UPLC-MS/MS法具有高通量、高灵敏度、高选择性等优点，能很好的解决分离问题，同时内标法定量又能有效校正基质效应等引起的误差，提高分析效率。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

THERMOTSQENDURA三重四极杆串联质谱仪(美国，赛默飞公司)；THERMOUltimate3000超高效液相色谱仪(美国，赛默飞公司)；IKAVORTEXGENIUS3(德国，IKA公司)；MD200-2氮吹仪(杭州奥盛仪器设备有限公司)；WatersOasisPRiMEHLB固相萃取柱(60mg/3cc,美国Waters公司)。

恩诺沙星，环丙沙星，达氟沙星，沙拉沙星，诺氟沙星,氟罗沙星，双氟沙星，氧氟沙星，司帕沙星，氟甲喹(所有标准品均来自德国Dr.E公司)，氘代诺氟沙星、氘代环丙沙星、氘代恩诺沙星标准品(德国DR.E公司)。标准储备溶液：分别称取10mg各标准品，置于10mL棕色容量瓶中，加甲酸200μL,用甲醇溶解定容至刻度，分别配制成1mg/mL的标准溶液，-20℃冰箱避光保存。吸取一定量的标准储备液，用流动相稀释配成混合标准溶液，按需要用初始流动相稀释成相应浓度的混合标准工作液，现配现用。混合内标标准溶液：分别称取氘代诺氟沙星、氘代环丙沙星、氘代恩诺沙星内标标准品各5mg，置于10mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，配制成0.5mg/mL的同位素内标标准储备液。准确吸取内标标准储备液适量，用甲醇稀释配成1.0μg/mL内标工作溶液，避光4℃保存，有效期一个月。乙腈、甲醇、正己烷(色谱纯，德国Sigma公司)；NaCl、无水Na2SO4(重庆川东化工有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1前处理方法准确称取匀质试样5.00 g(精确至0.01 g)于50 mL离心管中，加入混合内标标准工作液50 μL，加入2 g NaCl，涡旋混合30 s，加入酸化乙腈10 mL，涡旋混合1 min，超声提取10 min，8 000 r/min离心5 min。取上清液于另一50 mL离心管中，残渣中加10 mL酸化乙腈，重复提取一次，合并两次提取液。取10 mL上清液过PRiME HLB小柱，保持1 mL/min的流速，收集全部流出液，40 ℃氮气吹干，再加1 mL 5%甲醇涡旋溶解残留物，过0.22 μm微孔滤膜，供UPLC-MS/MS测定，内标法定量。其中氟罗沙星、氧氟沙星、诺氟沙星以氘代诺氟沙星为内标；达氟沙星、双氟沙星和环丙沙星以氘代环丙沙星为内标；恩诺沙星、沙拉沙星、司帕沙星、氟甲喹以氘代恩诺沙星为内标。

1.2.2液相色谱-质谱条件色谱柱：Hypersil GOLD柱(50×2.1 mm,1.9 μm)；流动相：A：0.1%甲酸水溶液，B:乙腈,流速：0.4 mL/min；柱温：室温；进样量：5 μL。梯度洗脱程序:0～0.5 min,90%A;0.5～1.0,90%～50%A;1.0～1.5,50%～10%A;1.5～3.0,10%～90%A;3.0～4.0,90%A。离子化模式：电喷雾正离子模式(ESI+)；喷雾电压：3 500 V;离子传输管温度：350 ℃；蒸发温度：300 ℃。选择多反应监测模式(MRM)，质谱参数见表1。

表1 各化合物质谱参数

(续表1)

CompoundPrecursor(m/z)Product(m/z)RF lens(V)Collision energy(eV)Sarafloxacin386.1299.114428.1386.1342.014418.6Difloxacin400.3299.016728.7400.3356.116717.1Fleroxacin370.0269.115725.0370.0326.015716.0Ofoxacin362.2261.215027.0362.2318.315018.0Sparfloxacin393.1292.116523.7393.1349.116517.1Flumequin262.1202.116336.1262.1244.016320.1Enrofloxacin-D5365.1321.115718.0Ciprofloxacin-D8340.1322.114621.0Norfloxacin-D5325.1302.113921.1

2 结果与讨论

2.1 提取液的优化

喹诺酮结构上有羧基和哌嗪基，具有酸碱两性，易溶于酸性或碱性溶剂，乙腈属于强极性溶剂，加酸或碱能增加溶剂的极性，影响提取效率[20]。本实验中比较了不同浓度的酸化乙腈(0.1%、1%和5%甲酸乙腈)提取目标化合物，并沉淀蛋白，结果见图1。从图中可以看出，用1%甲酸乙腈提取样品，10种目标物的回收率均能达到88%以上，效果较好。而用0.1%和5%甲酸乙腈处理样品，10种目标物的回收率差别较大，个别药物回收率较低。一部分原因可能是因为酸度太低，蛋白沉淀不够完全，导致离心时不够澄清，过小柱会有所损失，进而影响回收率；另一方面，酸度太高可能影响离子化效率，使样品的溶解性减弱。因此，综合考虑实验中选取1%甲酸乙腈来提取样品，沉淀蛋白。

2.2 前处理条件优化

比较了样品提取时分别添加NaCl、无水Na2SO4和正己烷的提取效果，见图2。从实验结果来看，添加NaCl的样品回收率在74%～110%之间；添加无水Na2SO4的样品回收率在62%～101%之间；添加正己烷的样品回收率在62%～108%之间(加标量1 μg/kg)，都符合国家标准(GBT 27404-2008)中对回收率的规定范围。但是在实验过程中发现，添加NaCl能沉淀部分蛋白，离心后的样品很清澈，方便后续净化上机；添加无水Na2SO4和正己烷的样品过柱之后相对要浑浊，给后续净化带来一定的难度。实验选择加入NaCl，再加入甲酸乙腈来沉淀蛋白。

图1 不同浓度甲酸乙腈提取液对喹诺酮类药物回收率的影响Fig.1 Effect of concentrations of formic acid acetonitrile on the recoveries of 10 quinolones

图2 不同盐类对喹诺酮类药物回收率的影响Fig.2 Salt effect on the recoveries of 10 quinolones

2.3 净化方式的优化

鸡蛋中含有大量的磷脂，极大地干扰了目标化合物的分析，损耗色谱柱寿命，以及增加仪器的维护成本。磷脂的主要成分是磷脂酰胆碱(PC)，磷脂酰胆碱是一种两性分子，由亲水的头部和疏水的尾部组成。极性头部基团易断裂，正离子模式下易产生特征碎片离子m/z184[21 - 23]。因此，本实验质谱方法中加入了监测184/184的MRM通道，即可实现对样品中磷脂含量的监测。

图3为净化前后的磷脂酰胆碱碎片离子的色谱图。从图中可以看出净化后的样品磷脂含量明显低于未净化的样品。说明PRiME HLB 小柱能有效去除磷脂等干扰物，同时也提高了净化效率，节约前处理时间。所以，本实验选择用PRiME HLB 固相萃取小柱净化后再上机测定。

图3 空白鸡蛋样品中磷脂离子色谱图 Fig.3 Chromatograms of PC product ion in egg sample (a) not cleaned up；(b) cleaned up by PRiME HLB.

2.4 流动相的优化

因喹诺酮类是酸碱两性物质，直接用乙腈和水做流动相，色谱峰容易拖尾。因其是正离子模式，可向流动相中加酸以增强其保留能力，考虑到质谱对流动相的特殊要求，本实验中以乙腈和0.1%甲酸水溶液作为流动相，可大大提高灵敏度，且色谱峰形更好。实验优化后的流动相及梯度洗脱程度见1.2.2项。

2.5 方法学验证

2.5.1线性方程及相关系数以样品浓度和各组分色谱峰面积作图，得到10种目标化合物的标准曲线，其线性方程和线性相关系数见表2。在浓度0.5～50 ng/mL范围内，10种喹诺酮类药物的峰面积和浓度呈现良好线性关系。

表2 标准曲线的线性方程和相关系数

2.5.2回收率、精密度及基质效应我国农业部235号公告对几种药物的限量标准为：恩诺沙星、环丙沙星在鸡蛋中禁用，其他几种未规定限量标准。参考在其他肌肉组织中的限量，其中限量最低的为沙拉沙星(10.0 μg/kg)。本实验分别进行了0.5、5、10 μg/kg三水平加标，按照1.2.1样品前处理方法进行处理，上机测定，每个添加水平进行6次平行测定。结果如表3 所示，回收率范围为 83.5%～102.5%，相对标准偏差(RSD)为2.7%～11.5%(n=6)，重复性良好。方法的准确度及精密度满足国家标准(GB/T 27404-2008)《实验室质量控制规范食品理化检测》的技术要求。

2.5.3方法检出限以信噪比(S/N)=3计算检出限。当进样量为5 μL时，鸡蛋中恩诺沙星、环丙沙星、达氟沙星、沙拉沙星、诺氟沙星、氟罗沙星、氧氟沙星、司帕沙星、双氟沙星、氟甲喹的检出限分别为：0.026、0.0038、0.0044、0.0023、0.0036、0.033、0.011、0.0054、0.033、0.016 μg/kg。方法灵敏度高，能满足实际样品检测需要。

2.6 方法运用

采用所建立的方法对市售的柴鸡蛋、鲜鸡蛋、土鸡蛋、绿壳鸡蛋和白壳鸡蛋5种鸡蛋样品均购买于超市，共30组样品进行取样检测。其中3份样品有检出，分别检出恩诺沙星、环丙沙星和诺氟沙星。其中，恩诺沙星含量为2.6 μg/kg；环丙沙星含量分别为3.4 μg/kg；诺氟沙星含量为2.5 μg/kg。目前国家监督抽检中只规定了恩诺沙星和环丙沙星为必检项目，但是从实验结果来看，其他几种药物也有必要纳入到监测范围，以便于进一步加强监测力度，确保老百姓舌尖上的安全。

表3 不同加标浓度喹诺酮类药物在鸡蛋样品中的回收率(n=6)

3 结论

本文研究建立了鸡蛋中10种喹诺酮类抗生素残留量的固相萃取UPLC-MS/MS测定方法。实验表明，该方法测定10种喹诺酮类药物在浓度0.5～50 ng/mL范围内具有良好的线性，分析结果满足喹诺酮类药物残留相关法规的限量要求和回收率、精密度要求。而且与目前相关的标准及其它文献报道的方法相比，既确保了准确性和精密度，又简化了前处理，适合大批量的日常分析检测，为建立同时快速测定兽药残留的研究提供了数据和支持。