不同稀释液对免疫层析法粪便隐血试验的影响

姚晓宾，王 丹，马卫国，曹伟娟，盛家和

(河南省肿瘤医院 检验科，郑州 450008)

不同稀释液对免疫层析法粪便隐血试验的影响

姚晓宾，王 丹，马卫国，曹伟娟，盛家和

(河南省肿瘤医院 检验科，郑州 450008)

摘要：目的比较采用生理盐水、去离子水、自来水作为样本稀释液对免疫层析粪便隐血试验结果的影响，明确隐血试验最适稀释液，提高隐血试验的准确率。方法采集正常人抗凝全血，用3种稀释液对其倍比稀释后进行隐血检测。通过肉眼观测及 Image J 图像处理软件灰度分析，比较三者差异。连续 2 周收集临床粪便标本，潜血检测使用 3 种稀释液同时测定，计算阳性率差异。结果全血检测生理盐水组灰度明显高于其他 2 组，P<0.05；自来水组和去离子水组相比差异无统计学意义，P>0.05；生理盐水/去离子水灰度比为 1.78±0.85；生理盐水/自来水灰度比为 2.12±0.72；自来水/去离子水灰度比为 0.80±0.05。结论生理盐水是粪便隐血试验的最适稀释液，相比其他稀释液，具有较高的阳性检出率。

关键词：生理盐水；去离子水；自来水；粪便隐血试验

中图分类号：R446.13

文献标识码：A

文章编号：编号： 1672-7606(2015)01-0040-03

收稿日期：2014-08-15

作者简介：姚晓宾(1979—)， 男，河南灵宝人， 硕士，主管技师，从事临床检验诊断的工作。

Abstract:ObjectiveComparison of normal saline, deionized water, tap water as the sample diluent for immunochromatographic fecal occult blood test to confirm optimum dilution for occult blood test and improve the accuracy of the occult blood test. MethodsAcquisition normal anticoagulated whole blood and occult blood detection with three dilutes. Comparison of the test difference by visual observation and grayscale image processing software Image J. Fecal occult blood detection of consecutive weeks clinical specimens was measured using three dilutes, calculated the difference of positive rate. ResultsGrey level of saline group with whole blood detection was significantly higher than the other two groups, P <0.05, however deionized water and tap water group showed no statistically significant difference, P>0.05. Grey ratio of saline/deionized water was 1.78 ± 0.85, saline/tap water was 2.12 ± 0.72, tap water/deionized water was 0.80 ± 0.05. Conclusion Saline is the most suitable dilutions for fecal occult blood test with a high positive rate compared to other diluents. The results suggest that we should use saline diluent and avoid tap water diluent at work.

The effect of different dilutions on immune chromatography fecal occult blood test

YAO Xiaobin, WANG Dan, MA Weiguo, CAO Weijuan, SHENG Jiahe

(DepartmentofClinicalLaboratory,HenanTumorHospital|AffiliatedTumorHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou,Henan450008,China)

Key words: Saline; Deionized water; Tap water; Fecal occult blood test

粪便隐血试验(facal occult blood test，FOBT)主要用于消化道出血、消化道肿瘤的筛查和鉴别诊断，也可辅助判断消化道炎症、溃疡、结核等病变。免疫法和化学法粪便隐血试验的方法学原理和评价在医学检验教材和全国临床检验操作规程中均有详细解析[1-2]，但是粪便稀释这一关键步骤均未作说明。粪便隐血试验免疫层析法是检测粪便中的游离血红蛋白，所以在产品设计和验证时均采用蒸馏水或去离子水作为样本稀释液[3-4],文献[5-6]报道在实验操作时常用生理盐水作为样本稀释液,日常工作中也有部分使用自来水作为样本的稀释液，认为自来水有助于红细胞破裂，可以充分释放细胞内的血红蛋白，更利于消化道出血的检出。本文就3种稀释液是否影响隐血试验结果的判读及检测的差异如何进行验证和讨论。

1材料和方法

1.1　全血倍比稀释样本潜血检测

新鲜全血红细胞，能够定量计数，用于评估商用潜血试纸条检测限，并选取合适浓度用于比较不同稀释液结果差异。采集 2 mL EDTA-K2抗凝全血，迈瑞BC-5500血细胞计数仪计数，选取红细胞数值介于(4~5)×1012、血红蛋白值介于120~140 g/L之间的样本。抗凝全血经生理盐水、去离子水、自来水 3 种稀释液 104、105、106倍稀释后用于隐血检测。

1.2　稀释和计数

微量移液器取 100 μL 全血，加入到 900 μL 稀释液中，充分吹打、颠倒混匀，依次稀释 104、105、106倍。不同稀释倍数均用改良牛鲍计数板计数红细胞数值，用于验证稀释倍数，误差不超过10%。隐血试验为免疫层析法，使用商用试剂盒，按说明书要求操作。5 min 后判读结果并相机照相。本实验样本例数为 6 例不同人血液，每例重复检测 3 次。

1.3　临床粪便标本潜血检测

连续2周收集临床各科送检的粪便常规标本 314 份，包括性状正常和异常标本。挑取相同部位和量的粪便，置含不同稀释液的样本稀释杯，充分混匀。潜血检测步骤同全血稀释样本潜血检测，试纸条出现肉眼可见的检测带即为阳性。

1.4　数据处理和统计

全血检测结果拍照，用Image J图像处理软件进行灰度分析，记录灰度值，并计算生理盐水/去离子水、生理盐水/自来水、自来水/去离子水的灰度比值。灰度值比较采用SPSS 13.0统计软件进行方差分析。临床粪便潜血检测结果比较则采用卡方检验进行差异分析。

2结果

2.1　全血稀释样本检测肉眼观察结果比较

3种不同稀释液 104倍数稀释样本均可见明显阳性带;105倍数稀释样本生理盐水组阳性带隐约可见，去离子水组和自来水组阳性带模糊不清;106倍数稀释样本阳性带均未显示。故以 104倍数稀释作为 3 种稀释液检测结果比较浓度。结果见图 1。测试条带均用Image J图像处理软件进行灰度分析，记录灰度值。生理盐水/去离子水灰度比为 1.78±0.85，生理盐水/自来水灰度比为 2.12±0.72，自来水/去离子水灰度比为 0.80±0.05。生理盐水组灰度明显高于其他 2 组，P<0.05；自来水组和去离子水组相比差异无统计学意义，P>0.05。见图 2。

2.2　临床粪便标本潜血检测结果

连续2周收集临床各科送检的粪便常规标本共 314 份，生理盐水组阳性率 23.45%，去离子水组阳性率 15.82%，自来水组阳性率 13.39%。生理盐水组阳性而去离子水或自来水组阴性的标本延长结果观测时间至 10 min 以上，结果仍为阴性。生理盐水组阳性检出率高于去离子水组，X2=16.24，P<0.01，高于自来水组，X2=17.31，P<0.01；去离子水组和生理盐水组比较，X2=4.39，P>0.05，2组潜血结果差异不明显。

3讨论

免疫层析法粪便隐血试验具有灵敏度高、特异性好、简便快速、试剂成本低等优点，临床应用广泛。但粪便存在体内和体外的 2 次稀释作用，即消化道出血后的血红蛋白首先有粪便的体内混匀稀释，操作时又存在取样稀释，2 次稀释会明显降低待检时的样本血红蛋白浓度，从而出现患者有消化道出血症状而潜血检测结果为阴性的可能。

我们的实验对全血稀释后潜血检测结果拍照取图，并用Image J图像处理软件进行灰度分析，使实验结果具有量化的可比性[7]。结果显示， 3 种稀释液 104倍数稀释全血均可见明显阳性条带，条带的颜色深浅具有较好的可比性。肉眼观察生理盐水阳性条带较去离子水和自来水明显，灰度比定量说明生理盐水稀释后血红蛋白浓度是去离子水的 1.78 倍，是自来水的 2.12 倍。去离子水和自来水稀释结果无明显差异。临床收集的粪便标本潜血检测结果显示，生理盐水组阳性率明显高于其他 2 组，去离子水稀释和自来水稀释 2 组差异不明显。从肉眼观察和实验数据分析认为，生理盐水稀释后检测灵敏度高，显色条带稳定且明显，利于观察结果。虽然去离子水和自来水为低渗介质，能够破坏红细胞膜，促使血红蛋白溢出，但是数据显示并未增强阳性显示，反而弱于生理盐水阳性条带。应考虑到生理盐水具有一定的离子强度和稳定的pH，为抗原抗体反应提供稳定的反应环境[8]；自来水含有消毒成分和较高含量重金属[9]，不利于抗原抗体的结合；去离子水或蒸馏水缺乏抗原抗体反应的离子介质，两者均不利于抗原抗体稳定结合，并顺利迁移至反应区和质控区。实验中还发现，滴入稀释后的血液，部分样本自来水先出现阳性条带，颜色较生理盐水和去离子水明显，但随时间延长超过 5 min 后，生理盐水阳性条带清晰度反而超过其他二者。可能为自来水中同时含有促进和抑制抗原抗体反应成分，形成的血红蛋白胶体金结合物非均匀迁移至阳性带。3种稀释液 104倍数稀释样本均能见明显检测带，105倍数稀释样本生理盐水组阳性带可见，去离子水组和自来水组阳性条带模糊不清，肉眼不可辨，故以此稀释浓度作为最高稀释浓度，计算所用商品试纸条本实验室检测限。我们的试验采用倍比稀释，稀释过程充分混匀，稀释后浓度均用改良牛鲍计数板验证，稀释误差不超过 10%。商品试纸条本实验室隐血检测最低浓度约 1 mg/L。

有文献[10-12]认为免疫法对上消化道出血不敏感，可能干扰实验的因素包括胃液酸性介质和消化酶的作用，在工作中存在的稀释因素，这些都减低了隐血的检出率，即降低了检测的灵敏度。因免疫法干扰因素少，特异性较好，实验室的检测限低于试剂理想限度，所以作者认为应适当延长观测时间，建议粪便隐血试验反应时间应大于 5 min，控制在 5~10 min。

综上所述，我们的试验用Image J图像处理软件进行灰度分析，使实验结果具有量化的可比性。数据表明，粪便隐血试验最适稀释液为生理盐水，不建议使用去离子水或自来水，结果观察时间宜控制在 5~10 min。

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[责任编辑姬荷]