GC法同时测定鲜竹沥中10种成分

肖小武， 林凯鹏， 周志强， 付辉政， 罗跃华， 陈伟康， 洪 挺

(江西省药品检验检测研究院,江西省药品与医疗器械质量工程技术研究中心,国家药品监督管理局中成药质量评价重点实验室,江西 南昌 330029)

鲜竹沥为禾本科植物粉绿竹PhyllostachysglaucaMcCluve、净竹PhyllostachysnudaMcClure及同属数种植物的鲜杆经加热后自然沥出的液体[1]，具有清热化痰功效，用于肺热咳嗽痰多、小儿痰热惊风等症[2]，含酚类、糖、氨基酸等成分，其中有效物质是愈创木酚、苯酚等及其同系酚性成分[3-7]，但现行质量标准未对以鲜竹沥为主要原料的复方鲜竹沥液等品种中的酚类进行控制[8]，相关研究报道仅涉及愈创木酚、苯酚[9-12]，而多组分测定只见UV法测定总酚含量及GC-MS法测定其相对含量[13-15]。本实验在前期对鲜竹沥中糖和氨基酸研究的基础上[16-17]，建立GC法同时对苯酚、对甲基苯酚、对乙基苯酚3个苯酚及其同系物，以及愈创木酚、4-甲基愈创木酚、4-乙基愈创木酚、4-乙烯基愈创木酚、6-甲氧基愈创木酚、异丁香酚、4-烯丙基-6甲氧基愈创木酚7个愈创木酚及其同系物的含量进行测定，以期为原材料选取及其质量标准制定提供依据。

1 材料

Agilent 8890B型GC色谱仪(美国Agilent公司)，配置氢火焰离子化检测器(FID)、7693型液体自动进样器、Openlab色谱工作站；BT25S型电子天平(十万分之一，德国赛多利斯公司)；Milli-Q超纯水仪(美国Millipore公司)。愈创木酚(批号111510-200202，纯度100.0%)、4-甲基愈创木酚(批号AL190815-27，纯度99.98%)、苯酚(批号G181013-04，纯度99.61%)、4-乙基愈创木酚(批号ZS190617-02，纯度98.46%)、甲基苯酚(批号G201021-05，纯度99.34%)、乙基苯酚(批号G191026-03，纯度99.27%)、4-乙烯基愈创木酚(批号MX190811-23，纯度98.46%)、6-甲氧基愈创木酚(批号MA190816-07，纯度99.08%)、异丁香酚(批号82718，纯度99.0%)、4-烯丙基-6-甲氧基愈创木酚(批号93727，纯度99.0%)对照品(中国食品药品检定研究院)。刚竹属毛竹、淡竹(粉绿竹)、净竹、雷竹、毛金竹、高节竹及大明竹属苦竹、仙居苦竹均采自江西省林业科学院竹类国家林木种质资源库，经江西省林业科学院竹类研究所余林副研究员鉴定为正品，并委托江西仁安药业有限公司通过工业生产干馏制备了鲜竹沥各3批。乙醚等其他试剂均为分析纯；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液制备 精密称取愈创木酚、4-甲基愈创木酚、苯酚、4-乙基愈创木酚、对甲基苯酚、对乙基苯酚、4-乙烯基愈创木酚、6-甲氧基愈创木酚、异丁香酚、4-烯丙基-6-甲氧基愈创木酚对照品适量，甲醇制成质量浓度分别为0.240 8、0.349 4、0.373 6、0.281 6、0.305 2、0.254 8、0.270 4、0.454 9、0.255 8、0.252 8 mg/mL的溶液，精密移取2.5 mL至25 mL量瓶中，甲醇稀释至刻度，即得，于4 ℃冰箱中保存备用。

2.2 供试品溶液制备 精密量取鲜竹沥20 mL,稀盐酸调节pH值至1～2,乙醚振摇提取3次，每次20 mL，合并乙醚液，乙醚液用20 mL 5%碳酸氢钠溶液洗涤，分离乙醚层，挥干，残渣加甲醇溶解并定容至5 mL,即得。

2.3 色谱条件 DB-WAX色谱柱(30 m×0.32 mm，0.25 μm)；载气N2，柱体积流量3.5 mL/min；分流比30∶1；进样口温度260 ℃；程序升温(初始温度75 ℃，保持0.5 min，5 ℃/min升至150 ℃保持0.5 min，3 ℃/min升至210 ℃)；FID检测器温度300 ℃；进样量1 μL。色谱图见图1。

1.愈创木酚 2.4-甲基愈创木酚 3.苯酚 4.6-甲氧基愈创木酚 5.对甲基苯酚 6.对乙基苯酚 7.4-乙烯基愈创木酚8.4-乙基愈创木酚 9.异丁香酚 10.4-烯丙基-6甲氧基-愈创木酚1.guaiacol 2.4-methyl guaiacol 3. phenol 4.6-methoxy guaiacol 5.p-methyl phenol 6.p-ethyl phenol 7.4-vinyl guaiacol 8.4-ethyl guaiacol 9.isoeugenol 10.4-allyl-6-methoxy guaiacol图1 各成分GC色谱图Fig.1 GC chromatograms of various constituents

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系考察 取“2.1”项下对照品溶液，依次稀释成所需质量浓度，在“2.3”项色谱条件下进样测定。以对照品质量浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)进行回归，结果见表1，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

2.4.2 精密度试验 取“2.1”项下对照品溶液，在“2.3”项色谱条件下进样测定6次，测得愈创木酚、4-甲基愈创木酚、苯酚、4-乙基愈创木酚、对甲基苯酚、对乙基苯酚、4-乙烯基愈创木酚、6-甲氧基愈创木酚、异丁香酚、4-烯丙基-6甲氧基愈创木酚峰面积RSD分别为0.97%、1.22%、1.62%、0.60%、0.79%、0.65%、1.00%、0.85%、1.69%、0.82%，表明仪器精密度良好。

表1 各成分线性关系

2.4.3 重复性试验 取同一批鲜竹沥(雷竹)，按“2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，在“2.3”项色谱条件下进样测定6次，测得愈创木酚、4-甲基愈创木酚、苯酚、4-乙基愈创木酚、对甲基苯酚、对乙基苯酚、4-乙烯基愈创木酚、6-甲氧基愈创木酚、异丁香酚、4-烯丙基-6甲氧基愈创木酚含量RSD分别为1.02%、0.87%、0.96%、1.21%、0.54%、0.62%、1.25%、0.53%、0.67%、0.81%，表明该方法重复性良好。

2.4.4 稳定性试验 取同一批鲜竹沥(雷竹)，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，于0、6、12、18、24 h在“2.3”色谱条件下进样测定，测得愈创木酚、4-甲基愈创木酚、苯酚、4-乙基愈创木酚、对甲基苯酚、对乙基苯酚、4-乙烯基愈创木酚、6-甲氧基愈创木酚、异丁香酚、4-烯丙基-6甲氧基愈创木酚峰面积RSD分别为0.46%、0.86%、1.06%、0.87%、1.16%、1.49%、1.24%、0.65%、1.30%、0.65%，表明溶液在24 h内稳定性良好。

2.4.5 加样回收率试验 精密量取各成分含量已知的鲜竹沥液(雷竹)6份，每份10 mL，精密加入等量对照品溶液，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.3”色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，苯酚、甲基苯酚、愈创木酚、乙基苯酚、4-甲基愈创木酚、4-乙基愈创木酚、4-乙烯基愈创木酚、6-甲氧基愈创木酚、异丁香酚、4-烯丙基-6-甲氧基愈创木酚平均加样回收率分别为96.69%、97.68%、99.02%、98.88%、99.06%、99.77%、98.16%、101.01%、99.40%、98.23%，RSD分别为1.38%、1.88%、2.64%、2.51%、1.88%、2.74%、0.79%、1.41%、2.48%、1.32%。

2.4.6 样品含量测定 取8种基原样品各3批，每批2份，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.3”色谱条件下进行测定，计算含量，结果见表2。

表2 不同基原样品中各成分含量测定结果(μg/mL，n=2)

3 讨论

3.1 前处理条件考察

3.1.1 萃取溶剂 本实验考察了正丁醇、乙酸乙酯、乙醚，以各成分含量为指标，发现相对于乙醚，正丁醇、乙酸乙酯萃取所得愈创木酚、丁香醛含量较低，而且乙醚更易挥发，故选择其作为萃取溶剂。

3.1.2 萃取体积和次数 本实验考察了10、20、 30、40 mL乙醚萃取不同次数，以各成分含量为指标，发现与样品同等体积时含量达到最高，增加体积、次数无明显变化，故选择20 mL乙醚萃取3次。

3.2 色谱条件优化 由于6-甲氧基愈创木酚色谱峰较大，4-乙烯基愈创木酚较小，而且两者较难分离，故参考文献[18]对升温程序和分流比进行优化。在保证各成分色谱峰分离度、峰形、出峰时间的情况下，确定为“2.3”项下色谱条件。

3.3 结果分析

3.3.1 基原 不同基原样品中各成分总含量依次为毛竹>毛金竹>淡竹>雷竹>苦竹>仙居苦竹>苦竹>净竹>高节竹；在愈创木酚及其同系物和苯酚及其同系物的含量方面，毛竹最高。目前，鲜竹沥质量标准未涉及毛竹，只列出淡竹和净竹，但调研发现，江西、浙江、湖南等鲜竹沥主产区毛竹资源丰富，淡竹、净竹相对匮乏，故企业采用毛竹为原料来加工炮制。基于上述情况，建议修订相关标准时将毛竹纳入其中。

3.3.2 成分种类 不同基原样品中含量最高的成分均为6-甲氧基愈创木酚，其次是愈创木酚，但现行鲜竹沥质量标准并未对酚类进行质量控制，而2020年版《中国药典》对复方鲜竹沥液、竹沥达痰丸也未作类似规定。因此，建议修订相关标准时将6-甲氧基愈创木酚、愈创木酚等成分或多组分酚类特征图谱纳入其中。

3.3.3 成分限度 6-甲氧基愈创木酚在毛竹、毛金竹中的含量均高于200.00 μg/mL，但在净竹、高节竹中均低于50.00 μg/mL；愈创木酚在毛竹、毛金竹中含量均高于50.00 μg/mL，但在净竹、高节竹中均低于5.00 μg/mL。按平均值的70%计算，暂定为每1 mL鲜竹沥含愈创木酚(C7H8O2)不得少于40.0 μg，6-甲氧基愈创木酚(C8H10O3)不得少于145.0 μg。另外，各成分含量差异较大，故采用特征图谱作为多组分酚类的质控指标。