假肥大型肌营养不良患儿的血清酶学与基因特征分析

黄彩芝 张聪 李爱国 莫丽亚

湖南省儿童医院检验中心（长沙 410007）

假肥大型肌营养不良（pseudohypertrophic mus⁃cular dystrophy）是进行性肌营养不良中最常见的一种严重神经肌肉系统疾病，为X连锁隐性遗传病，其病理改变是抗肌萎缩蛋白基因缺失或突变而致肌纤维膜上的抗肌萎缩蛋白表达缺乏，导致肌纤维进行性变性坏死［1-3］。根据抗肌萎缩蛋白表达缺乏的程度，可将该病分为Duchenne肌营养不良（Duchenne muscular dystrophy，DMD）和Becker肌营养不良（Becker muscular dystrophy，BMD）两种表型，临床上最常见的假肥大型肌营养不良是DMD［4］。目前国内外对DMD/BMD虽无有效的治疗方法，但早期准确识别该病并采取适当的干预措施可延缓病情、延长患儿生命，提高生存质量［5］。本研究通过对118例DMD/BMD患儿的血清酶学与基因特征进行分析，旨在提高对本病的早期认识及诊断水平。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2014年1月至2016年12月在我院临床诊断为DMD/BMD并要求基因诊断的118例患儿作为研究对象。DMD/BMD的临床诊断根据《儿科学》第七版关于假肥大型肌营养不良的诊断标准［6］，并排除其他常见神经系统疾病与遗传代谢性肌病。随机选取同期在我院儿童保健科体检的健康男性儿童40例作为正常对照组。本研究获得医院伦理委员会批准，入选患儿均征得监护人知情同意。

1.2 方法

1.2.1 标本采集和处理 所有研究对象清晨空腹抽取静脉血4.0 mL，其中2.0 mL EDTA⁃K2抗凝血提取DNA用于基因检测，另2.0 mL未抗凝血分离血清用于丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotrans⁃feras，ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（aspartate ami⁃notransferase，AST）、乳酸脱氢酶（lactic dehydroge⁃nase，LDH）、肌酸激酶（creatine kinase，CK）、肌酸激酶同工酶MB（creatine kinase MB，CK⁃MB）、肌红蛋白（myoglobin，MB）、羟丁酸脱氢酶（hydroxybu⁃tyrate dehydrogenase，HBDH）等酶学检测。基因检测3周内完成，其余各项指标检测均在采血后2 h内完成。

1.2.2 血清酶学检测 采用速率法检测血清ALT、AST、LDH、CK、HBDH，免疫抑制法检测CK⁃MB，胶乳免疫比浊法检测MB，所用仪器为美国西门子2400全自动生化分析仪，试剂由上海科华生物工程股份有限公司提供（ALT批号2014036Q、2015072Q；AST批号2014022Q、2015012Q；LDH批号2014062Q、2015121Q；CK批号20141012、0150912；HBDH 批 号 20130918、16051102；CK⁃MB 批号20140222、20151212；MB批号20131212、160510），由专人严格按操作规程进行操作，所有项目质控合格，仪器状态正常。酶学指标异常标准：ALT＞40 U/L、AST＞40 U/L、LDH＞450 U/L、CK＞174 U/L、CK⁃MB＞24 U/L、MB＞90 ng/mL、HBDH＞182 U/L。

1.2.3 基因检测 采用多重连接酶依赖探针扩增（multiplex ligation⁃dependent probe amplification，MLPA）技术（试剂为荷兰SALSA公司生产的P034型和P035型试剂盒）检测待检样本DMD基因的79个外显子，用正常DNA作为参照，从而检测DMD基因是否发生缺失或重复突变。当检测到单个外显子缺失时，进一步应用PCR技术、基因测序技术进行验证。

1.3 统计学方法 使用SPSS软件对数据进行统计学分析，计量资料以中位数（四分位数范围）［M（P25～P75）］表示，组间比较采用 Mann⁃WhitneyU非参数秩和检验。采用ROC曲线法评价ALT、AST、LDH、CK、CK⁃MB、MB、HBDH对DMD/BMD患儿基因诊断的预测能力，以约登指数（Youden′s index）最大时的临界值作为截断值。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料 118例DMD/BMD患儿均为男性，最大年龄133个月，最小1个月；其中学龄前患儿（＜72月）82例，学龄期患儿（≥ 72月）36例。118例患儿中52例（44.07%）具有明显临床症状与体征，包括双下肢或四肢乏力，行走缓慢，易跌倒，呈鸭步，跑步及爬楼梯困难，Gowers征阳性，可见翼状肩、腓肠肌肥大等，其中14例有肌营养不良家族史；66例（55.93%）暂无明显临床表现患儿中仅1例有家族史。所有患儿行肌电图检查，结果均提示“肌源性病损电生理改变”。1例行腓肠肌活检，结果提示“肌纤维结构部分清楚，可见横纹结构，未见脂肪变性或糖原性空泡改变，未见明显炎细胞浸润，部分肌束明显变圆，肌细胞横纹消失”。

2.2 血清酶学检测结果 DMD/BMD患儿的血清酶学结果明显高于正常对照组儿童，差异均有统计学意义（均P＜ 0.001），ALT、AST、LDH、CK、CK⁃MB、MB、HBDH最高水平分别达正常上限19倍、17倍、12倍、150倍、35倍、32倍、12倍。见表1。

表1 DMD/BMD患儿与正常儿童的血清酶学比较Tab.1 serum enzymes comparison between DMD/BMD group and control group M（P25～P75）

学龄前患儿的CK和CK⁃MB水平明显高于学龄期患儿（均P＜0.01），而 ALT、AST、LDH、MB、HBDH水平在两组患儿中的差异均无统计学意义（均P＞0.05）。见表2。

表2 学龄前患儿与学龄期患儿的血清酶学比较Tab.2 serum enzymes comparison between preschool group and school age group M（P25～P75）

2.3 基因检测结果 118例临床诊断DMD/BMD患儿采用MLPA检测DMD基因，阳性结果91例，检出率77.12%，74例（81.32%）检出外显子缺失，其中单个外显子缺失17例，经PCR验证均无扩增条带，提示确为相应外显子缺失；17例（18.68%）检出外显子重复。缺失外显子位于中央缺失热区（44-52号外显子）内的检出率为60.81%（45/74），位于5′端缺失热区（2～20号外显子）内的检出率为6.76%（5/74）。91例MLPA检测阳性患儿中，发生小片段（＜5外显子）缺失及重复突变44例（48.35%），发生大片段（＞30外显子）缺失及重复突变8例（8.79%），最大可见连续63个外显子缺失（17～79号外显子缺失）。

27例MLPA检测阴性的患儿中有8例接受基因测序检查，其中6例检出突变，分别为外显子无义突变 4例：Ex75c.（10603_10622delinsTGATG）、Ex46c.（6677G＞A）、Ex63c.（9258delC）、Ex11c.（1201C＞T）；外显子移码突变1例：Ex10c.（1019delA）；内含子剪接突变1例：Intr45c.（6614+1G＞C）。

2.4 ROC曲线分析 ROC曲线分析显示，CK和CK⁃MB用于预测DMD/BMD患儿基因诊断阳性具有显著统计学意义（均P＜0.01），曲线下面积分别为0.74和0.69，CK＞2 178.85 U/L时诊断灵敏度为0.63，特异度为0.81，CK⁃MB ＞ 121.89 U/L时诊断灵敏度为 0.78，特异度为 0.52，而 ALT、AST、LDH、MB、HBDH用于判断DMD/BMD患儿基因诊断情况无统计学意义（均P＞0.05）。CK和CK⁃MB两者联合应用（CK+CK⁃MB）时对DMD/BMD患儿基因诊断阳性预测的曲线下面积为0.79，灵敏度0.84，特异度0.62。见图1。

3 讨论

图1 各检测指标对DMD/BMD患儿基因诊断预测的ROC曲线Fig.1 ROC curves of the indexes in predicting gene diagnosis for DMD/BMD children

假肥大型肌营养不良（DMD/BMD）发病率为新生男婴1/3 000～1/4 000，女性一般为携带者，2/3患儿的病变基因来自于母亲，另有约1/3患儿为新发突变，与母亲遗传无关［7］。该病起病隐匿，早期不易察觉，多于3～5岁发病，初期可见动作笨拙，随后逐渐出现上楼梯及蹲下后起立困难，鸭行步态等，体格检查示肌肉萎缩明显，呈进行性加重，以四肢近端肌，盆带肌为著，腓肠肌假性肥大，随病情缓慢进行性加重，逐渐卧床，多于20～30岁左右因呼吸衰竭或心功能不全而死亡。

研究发现DMD/BMD患儿血清CK明显升高，同时 LDH、CK⁃MB、MB 均增高［8］，主要是由于DMD/BMD患儿抗肌萎缩蛋白缺陷导致肌纤维损伤坏死，大量CK、LDH、CK⁃MB、MB从肌细胞逸出进入血液所致。本组患儿的血清ALT、AST、LDH、CK、CK⁃MB、MB、HBDH水平均明显升高，其中CK升高最明显，最高值达正常上限的150倍，这是由于CK主要存在于体内骨骼肌、心肌和平滑肌中，其中在骨骼肌中含量最高，而DMD/BMD患儿的骨骼肌和心肌均可受累，故血CK极度升高，此点有助于与其他型肌营养不良鉴别。学龄前患儿的CK和CK⁃MB水平明显高于学龄期患儿，说明在病变早期肌纤维进行性损伤、坏死，酶快速释放，CK值升高明显，到疾病的中后期，大部分肌纤维已被破坏，纤维结缔组织和脂肪组织浸润受损的肌肉组织，正常肌纤维减少，CK活力逐渐下降，同时亦提示在DMD/BMD患儿起病早期心肌即可受累从而引起心肌细胞破坏、心肌萎缩和CK⁃MB水平升高［9］。本组有66例患儿无明显临床表现，其中41例在常规健康体检时发现ALT与AST升高、25例因其它疾病治愈后血清CK仍异常升高而被进一步诊断为DMD/BMD，提示患儿可能在发病前期就已经存在肌细胞的损害，因此临床上对不明原因的血清酶学明显升高应拓宽诊断思路警惕本病的可能，血清酶学指标可作为诊断DMD/BMD敏感的标志物，早期检测可明显减少该病的延迟诊断，在儿童健康监测与疾病筛查中可作为常规检测指标［10-11］。

DMD和BMD是同一DMD基因突变所致的不同临床表现类型，DMD致病基因位于Xp21，该基因的突变率约1/10 000，远高于其他基因的突变频率；且突变形式多样，外显子缺失突变是主要的突变类型，其次为重复突变、点突变、小缺失及插入、剪切位点改变等，其中点突变多为无义突变［12］。本研究采用MLPA技术对118例临床诊断DMD/BMD的患儿进行基因检测，发现91例（77.12%）患儿存在外显子缺失或重复突变，60.81%（45/74）外显子缺失突变集中在44～52号外显子缺失热点区域，与文献报道基本一致［13］。MLPA检测阳性患儿中，发生小片段缺失及重复突变的例数较多（44例），发生大片段缺失及重复突变的有8例，最大可见连续63个外显子缺失。有27例患儿MLPA检测结果呈阴性，可能是由于DMD基因发生了探针识别序列以外的微小改变，而MLPA技术的检测局限性使其不能检出基因点突变［14-15］，对这一部分患儿建议通过测序进行微小突变筛查，本研究中8例接受了基因测序检查，其中6例检出突变。

DMD/BMD基因诊断准确可靠，可明确致病基因，为遗传咨询与未来可能的基因治疗提供了依据，但因其费用昂贵及设备技术要求高等原因限制了其在临床上的应用。本研究中ROC结果表明，CK ＞2 178.85 U/L、CK⁃MB ＞121.89 U/L时对基因诊断阳性具有较高的预测能力，两者联合应用时对临床诊断为DMD/BMD的患儿预测基因诊断阳性的曲线下面积为0.79，灵敏度0.84，特异度0.62，且血清酶学检测对DMD/BMD筛查具有简便快速、经济可行、依从性好的优点，尤其在基层医院极具应用价值，有利于减轻患儿家属经济负担并协助临床医师正确选择诊治方案。本研究的不足之处在于，仍有19例MLPA检测结果呈阴性的患儿因未接受基因测序检查而未能明确诊断，可能导致研究结果分析存在一定偏差，有待进一步的深入研究。