Survivin基因沉默促进胃癌细胞凋亡及其机制研究

毛苇 赵心恺 孔灿灿 邝继孙 邱敏霞

海南省人民医院消化科（海口 570311）

胃癌是常见恶性肿瘤之一，严重威胁着人类的健康，发病率占全球第5位，病死率占第6位［1］。每年新发病例93.4万例，且35%以上出现在中国［2］。胃癌常采用手术治疗的方法，但预后较差，复发率和转移率较高，其主要原因是胃癌细胞的恶性增殖导致肿瘤无法控制最终导致死亡，且晚期患者不易采用手术治疗［3］。分子靶向治疗是目前临床研究的重点和热点，因此探究胃癌的发病机制，为胃病的治疗提供可靠的潜在靶位点迫在眉睫［4］。Survivin基因为新近发现的凋亡抑制因子，通过抑制凋亡通路下游信号转导通路发挥作用，具有促进细胞转化、增殖的作用［5-6］。近年来随着对Survivin基因的深入研究，其在肿瘤中的作用越来越受到人们的重视。本实验通过检测Survivin基因在胃癌组织和癌旁注重中的表达量以及沉默Survivin基因对胃癌MKN⁃45细胞增殖、凋亡的影响，以此探明Survivin基因促进癌细胞凋亡的作用机制，为胃癌的临床治疗提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 样本的收集 50例胃癌和癌旁组织收集于我院2015年5月至2017年12月手术切除的患者，癌旁组织距肿瘤边缘≥2 cm，并经病理学确认为胃癌。术前患者均未接受任何化疗、放疗等。其中男患者23例，女患者27例，平均年龄58.12岁。所有样本的采集均获得患者或者家属的同意。

1.2 试剂 人胃癌MKN⁃45细胞株购自中科院上海细胞库；蛋白提取试剂盒购自南京建成生物工程研究所；DMEM培养基购自Gibco公司；胎牛血清、CCK8（Cell Counting Kit⁃8）购自北京碧云天生物技术公司；脂质体Lipofectamine2000、TRizol试剂购自Invitrogen公司；Annexin V⁃FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购自瑞士Roche公司；反转录试剂盒购自美国Thermo公司；一抗、二抗均购自美国Abcam公司。

1.3 Survivin基因在胃癌及癌旁组织的表达qRT⁃PCR测定Survivin mRNA在胃癌和癌旁组织中的表达量。根据TRizol试剂说明书提取胃癌和癌旁组织总RNA，反转录成cDNA。使用Primer 5软件设计Survivin和内参β⁃actin的引物。Survivin引物上游序列为为5′⁃GGACCACCGCATCTCTAC⁃AT⁃3′，下游序列为5′⁃GCACTTTCTTCGCAGTTT⁃3′；β⁃actin 引物上游序列为 5′⁃GTGGGGCGCCCCAG⁃GCACC A⁃3′，下游序列为5′⁃CTCCTTAATGTCACG⁃CACGATTTC⁃3′。PCR反应条件：预变性94℃ 5 min，94 ℃ 40 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，共 40个循环，72℃延伸10 min。每个样品设置3个重复，利用2⁃△△Ct法计算胃癌及癌旁组织中Survivin基因的mRNA相对表达量。

Western blot检测胃癌和癌旁组织中蛋白的表达量。根据蛋白提取试剂盒说明书提取胃癌和癌旁组织中总蛋白，二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法测定蛋白含量。取60 μg蛋白稀释成20 μL，加入等体积的1×SDS上样缓冲液，沸水煮开10 min，10%SDS⁃聚丙烯酰胺凝胶（SDS⁃PAGE）电泳，然后转移至硝酸纤维素膜（PVDF）上，5%的脱脂牛奶封闭30 min，加入一抗4℃过夜，次日Tris⁃HCl缓冲盐溶液+Tween（TBST）洗3遍，与二抗作用2 h，用TBST洗膜3次，滴加Electro⁃Chemi⁃Lumi⁃nescence（ECL）电化学发光显色液，在凝胶成像系统下测定灰度值。

1.4 细胞培养和转染 将人胃癌MKN⁃45细胞置于含有10%胎牛血清、青霉素（100 U/mL）、链霉素（100 μg/mL）DMEM培养基中培养中，37℃、5%CO2、饱和湿度恒温箱中培养，每24 h换培养基，胰酶消化后，2～3 d传代1次。

按照Lipofectamine2000转染试剂说明书，将Lipofectamine2000和siRNA按1∶1用量，取对数生长的MKN⁃45细胞按每孔5×105个接种至6孔板中，含10%胎牛血清DMEM培养基培养，当细胞生长达30%～50%时转染，实验分3组：（1）空白对照组（Normal）即未转染的细胞；（2）siRNA对照组（si⁃Control）中加入5 μL Lipofectamine2000，5 μL错配的siRNA（50 nmol/L·mL）；（3）siRNA实验组（si⁃Survivin）中加入 5 μL Lipofectamine2000，5 μL siRNA⁃Survivin（50 nmol/L·mL）。Western blot检测转染效果。

1.5 CCK8法检测细胞增殖 取上述转染细胞，每孔2 000个细胞接种于96孔板上，37℃、5%CO2、饱和湿度恒温箱中培养 24、48、72、96 h，每孔加入10 μL CCK8溶液，37℃孵育4 h，酶联免疫检测仪测每孔以空白组调零，OD450 nm处的吸光值A，每组4个复孔，试验重复3次，并绘制生长曲线。

1.6 流式细胞术检测细胞凋亡率 取转染培养48 h的细胞，加入胰酶消化，离心，PBS洗涤后加入400 μL 缓冲液，5μL Annexin V⁃FITC染色液，8 ℃孵育15 min；加10 μL PI染色液，8 ℃孵育15 min；采用流式细胞仪检测其凋亡率，试验重复3次。

1.7 Western blot检测β⁃catenin、Cyclin D1、Cas⁃pase⁃3蛋白的表达 从培养箱中取出6孔板，PBS清洗细胞，加入300 μL/孔裂解液，离心，加5×SDS上样缓冲液，沸水煮开10 min，离心，将提取的蛋白保存于-20℃。实验方法同1.3。

1.8 统计学方法 采用SPSS 21.0对数据进行分析，用平均数±标准差表示，两组差异采用t检验，多组间经单因素方差分析，组间多重比较经SNK⁃q检验，以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 Survivin基因在胃癌及癌旁组织中的表达情况 qRT⁃PCR检测胃癌和癌旁组织中Survivin mRNA表达量。胃癌中Survivin mRNA表达量为3.384±0.149，癌旁组织中的表达量为0.052±0.007；经统计分析，差异具有统计学意义（t=38.690，P＜0.05）。Western blot检测胃癌和癌旁组织中Survivin蛋白的表达量。胃癌中Survivin蛋白的表达量为1.358±0.027，癌旁组织中的表达量为0.021±0.008，经统计分析，差异具有统计学意义（t=82.235，P＜ 0.05）。

图1 Survivin基因在胃癌及癌旁组织中的表达情况Fig.1 expression of Survivin gene in gastric cancer and adjacent tissues

2.2 胃癌MKN⁃45细胞转染后Survivin蛋白的表达量 Western blot检测实验组（si⁃Survivin）、对照组（si⁃Control）、空白组（Normal）胃癌MKN⁃45细胞中Survivin蛋白的表达水平，3组细胞中Survivin蛋白的表达水平分别为（0.203±0.015）、（0.987±0.053）、（0.936± 0.046），3组整体比较差异具有统计学意义（F=336.276，P=0.000）。如图2所示，si⁃Survivin组Survivin蛋白表达量显著低于si⁃Control组、Normal组（P＜ 0.05）。

2.3 转染后胃癌MKN⁃45细胞增殖情况 如图3所示，siRNA⁃Survivin转染人胃癌MKN⁃45细胞后，细胞增殖明显受到抑制，增殖抑制效果随着时间的增加越来越明显，从48 h开始差异有统计学意义（P＜ 0.05），与Normal组相比，si⁃Survivin组72、96 h时差异有统计学意义（P＜ 0.05）；si⁃Control组与Normal组差异无统计学意义。

图2 si⁃Survivin转染胃癌MKN⁃45细胞后Survivin蛋白的表达Fig.2 Expression of Survivin protein of gastric cancer MKN⁃45 cells after transfected with si⁃Survivin

图3 si⁃Survivin转染胃癌MKN⁃45细胞后细胞生长曲线Fig.3 cell growth curve of gastric cancer MKN⁃45 cells after transfected with si⁃Survivin

2.4 转染后胃癌MKN⁃45细胞凋亡情况 流式细胞仪检测实验组（si⁃Survivin）、对照组（si⁃Control）、空白组（Normal）胃癌MKN⁃45细胞凋亡率。如图4，表1所示，si⁃Survivin组MKN⁃45细胞凋亡率为（28.76 ± 3.46）%，si⁃Control组和Normal组分别为（6.38±1.03）%、（5.89±1.13）%。统计分析结果显示si⁃Survivin组细胞凋亡率显著高于si⁃Control组和Normal组（P＜ 0.05）；si⁃Control组和Normal组间细胞凋亡率差异无统计学意义。

图4 转染si⁃Survivin对MKN⁃45细胞凋亡的影响Fig.4 Effect of apoptosis of MKN⁃45 cells after transfected with si⁃Survivin

表1 转染si⁃Survivin对MKN⁃45细胞凋亡的影响Tab.1 Effect of apoptosis of MKN⁃45 cells after transfected with si⁃Survivin

2.5 转染胃癌MKN⁃45细胞对β⁃catenin、Cyclin D1、Caspase⁃3蛋白表达量的影响 Western blot检测转染si⁃Survivin后胃癌MKN⁃45细胞caspase3、β⁃catenin、Cyclin D1的蛋白表达量。如图5、表2所示，caspase⁃3蛋白在si⁃Survivin组的表达量显著高于 Normal组和 si⁃Control组（P＜ 0.05）；β⁃catenin、Cyclin D1蛋白在si⁃Survivin组的表达量显著低于Normal组和si⁃Control组（P＜ 0.05）。

图5 转染si⁃Survivin后Caspase3、β⁃catenin、Cyclin D1的蛋白表达Fig.5 The expression of Caspase3，β⁃catenin and Cyclin D1 protein after transfected with si⁃Survivin

表2 转染si⁃Survivin后caspase3、β⁃catenin、Cyclin D1的蛋白表达量Tab.2 The expression of Caspase3，β⁃catenin and Cyclin D1 protein after transfected with si⁃Survivin ±s

表2 转染si⁃Survivin后caspase3、β⁃catenin、Cyclin D1的蛋白表达量Tab.2 The expression of Caspase3，β⁃catenin and Cyclin D1 protein after transfected with si⁃Survivin ±s

蛋白caspase3 β⁃catenin Cyclin D1 Normal 0.052±0.016 0.942±0.089 0.589±0.042 si⁃Control 0.050±0.019 0.953±0.071 0.591±0.030 si⁃Survivin 0.136±0.015**0.310±0.037**0.162±0.013**F值25.753 85.095 193.986 P值0.001 0.000 0.000

3 讨论

Survivin是凋亡抑制蛋白家族（inhibitor of apoptosis proteins，IAP）的成员之一，在肿瘤细胞增殖、凋亡、以及血管形成过程中发挥重要作用。近年来，Survivin对细胞的强抑制能力成为研究的热点之一［7］。肿瘤的发生与细胞凋亡、增殖能力密切相关。细胞增殖、凋亡是一种复杂的生理性过程，由一系列基因、信号传导通路共同作用调节，对维持细胞内环境稳态有很重要的作用［8］。研究显示，Survivin在多种肿瘤中高度表达如原发性肝外胆管癌［9］、膀胱癌［10］、乳腺癌［11］、食管癌［12］等，但在正常组织中不表达或低表达。本实验通过qRT⁃PCR和Western blot检测胃癌组织和癌旁组织中Survivin mRNA、蛋白的表达量，结果显示，Survivin mRNA和蛋白在胃癌组织中高表达，但在癌旁组织中低表达，与前人的研究结果［13］一致，为胃癌的临床诊断提供依据。

RNA干扰（RNA inference，RNAi）是一种由双链RNA（diuble strand RNA，dsRNA）引发的特异性序列抑制其同源基因沉默的技术，出现时间虽较晚，但因其高度的专一性而具有广泛的研究和应用。目前该技术广泛应用于细胞培养、哺乳动物研究中，为众多基因功能的作用及机制的探索开辟了新路径。在子宫腺肌病中，Survivin的过表达可促进细胞增殖、侵袭［6］。研究［12］显示，抑制肿瘤组织中Survivin的表达，能够促进肿瘤细胞凋亡，抑制其增殖，进而提高治愈率。特异性沉默Survivin能显著抑制胃癌MGC⁃803细胞增殖，并增强其对塞来昔布的敏感性，为提高胃癌的化疗效果提供实验基础［14］。在本实验中，通过siRNA转染人胃癌MKN⁃45细胞，经检测显示，转染后的细胞中Survivin蛋白的表达量下降，且对细胞的增殖速度起到抑制作用，促进其凋亡，提示在胃癌的发生发展中，Survivin基因发挥癌基因的作用，为分子靶向治疗胃癌提供潜在靶点。

天冬氨酸蛋白水解酶（Caspase⁃3）是Caspase家族的成员之一，调控细胞凋亡过程［15-16］。Sur⁃vivin基因调节细胞凋亡主要通过参与细胞有丝分裂和直接抑制 caspase⁃3 活性［17］。由研究［18］报道，在白血病中诱发Caspase⁃3表达上调可促进细胞凋亡，这对于肿瘤的治疗具有重要作用。Wnt/β⁃catenin信号通路调控细胞的增殖分化过程，该通路的异常与多种肿瘤的发生、发展有密切关系［19-20］。β⁃catenin是Wnt信号通路的关键调节因子，其表达量可影响c⁃myc、Cyclin D1等靶基因的表达以此调节细胞的增殖、凋亡。β⁃catenin蛋白的表达可作为早期诊断胃癌的指标，其表达量可调控胃癌的发生［21］。细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）参与细胞有丝分裂过程，可调节细胞周期的变化［22］。本实验的研究结果显示，沉默Survivin可有效降低β⁃catenin、Cyclin D1蛋白的表达，且Caspase⁃3蛋白的表达量上调，说明Survivin可能通过与β⁃catenin、Cyclin D1和Caspase⁃3等凋亡相关蛋白共同作用，调节肿瘤细胞的凋亡率。

综上所述，Survivin基因和蛋白在胃癌组织中高度表达；RNA干扰沉默人胃癌Survivin基因的表达可通过抑制Wnt/β⁃catenin信号通路降低癌细胞的增殖及促进凋亡。但Survivin在胃癌细胞增殖、凋亡调控中的具体作用机制尚需进一步的探讨。此研究为临床上胃癌的基因诊断及靶向性治疗提供了理论基础。