顺铂联合他莫昔芬对卵巢癌A2780细胞增殖及凋亡的影响

王成双 佐满珍

1青岛市中心医院，青岛大学第二临床医学院肿瘤妇科（山东青岛 266042）；2宜昌市第一人民医院，三峡大学人民医院妇产科（湖北宜昌 443000）

卵巢癌是常见的妇科生殖系统恶性肿瘤之一，其病死率占各类妇科肿瘤之首，且有逐年增加的趋势［1］。大多数卵巢癌患者初次诊断即为晚期，2009年FIGO分期Ⅲ期或Ⅳ期的患者5年生存率分别为28%和16%［2］。目前肿瘤细胞减灭术联合辅助化疗依然是治疗卵巢癌的重要手段，而顺铂和卡铂等铂类药物是目前卵巢癌一线化疗的抗肿瘤药物，其细胞毒性作用主要通过进入细胞与DNA结合，导致其链内和链间交叉联结，继而使单链或双链DNA断裂，这种DNA损伤在无法修复的情况下可以导致细胞凋亡。铂类药物还可引起线粒体损伤，降低ATP酶活性导致细胞死亡［3］。多种因素参与了卵巢癌的发生［4-5］，研究证实，雌激素受体表达增加会抑制细胞凋亡，促进癌细胞增殖，并对化疗产生耐药［6-7］。

顺铂（DDP）具有广泛的抗肿瘤谱，在耐铂类药物的卵巢癌细胞中发现雌激素受体表达显著增加，提示其可能与铂类药物耐药有关［8］。他莫昔芬（tamoxifen，TAM）是经典的雌激素受体拮抗剂，近年来发现，用他莫昔芬处理乳腺癌细胞，可发生细胞浆浓缩、染色质凝聚、DNA断裂等形态学改变。DDP联合TAM对卵巢癌细胞的作用目前研究较少，本课题研究了DDP联合TAM对A2780细胞增殖抑制、凋亡、细胞周期的影响，以期为基础和临床研究提供相关依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究对象 人卵巢癌A2780细胞株由华中科技大学药理实验室赠送，由三峡大学医学院冻存传代，于37℃，5%CO2培养。

1.1.2 主要药品、试剂 注射用顺铂购自山东齐鲁制药有限公司；枸橼酸他莫昔芬（纯度＞99.00%）购自大连美仑生物技术有限公司；进口胎牛血清购自上海原创生物科技有限公司；四甲基偶氮唑蓝、DMEM培养基、Annexin V/PI试剂盒均购于美国Gbico公司。

1.2 方法

1.2.1 MTT法检测DDP及TAM对人卵巢癌细胞株A2780抑制率 实验分3个处理组：空白组（只含培养液，无细胞及药物处理）、对照组（正常培养细胞，但无药物处理）及药物组（正常培养细胞，并予以药物处理）。胰酶消化对数生长期的A2780细胞，接种于96孔培养板，每孔2×103个细胞，24 h后更换培养液，以DMEM培养液配制药品，使DDP终浓度为0.625、1.25、2.5、5、10 μg/mL；TAM终浓度分别为1× 10-6、1× 10-5、2.5× 10-5、5× 10-5、7.5× 10-5、2× 10-4mol/mL；取3个检测点（24、48、72 h），6复孔/组，培养后每孔加入20 μL浓度为50 mg/mL MTT溶液，培养4 h后弃掉上清液，每孔加入150 μL DMSO避光震荡10 min，待沉淀溶解后，于酶标仪490 nm波长处测定OD值，各组取平均值。细胞抑制率（%）=1-药物组OD/对照组OD×100%。根据半数抑制浓度计算软件计算IC50。

1.2.2 Hoechst染色检测A2780细胞凋亡 胰酶消化重悬对数生长的A2780细胞，用台盼蓝染色，调整细胞浓度为2×104个/mL。将盖破片置于六孔板内，种入细胞4×104个，培养过夜，使细胞50%～80%融合。用药物处理A2780后除去培养液，根据Hoechst 33258试剂盒说明书操作。

1.2.3 流式细胞术（FCM）检测细胞周期 胰酶消化对数生长期的A2780细胞，接种于25 mL2培养瓶中，每瓶4×104个细胞，培养融合至70%～80%，给药后继续培养72 h，制备单细胞悬液，后按Annexin V/PI试剂盒说明书操作，记录细胞周期各时相百分比。

1.3 统计学方法 应用SPSS 18.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差表示，组内及组间两两比较采用LSD法；当P＜0.05时，认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同药物浓度、不同作用时间时卵巢癌A2780细胞抑制率

2.1.1 不同药物浓度DDP对A2780细胞的抑制率 以MTT法检测不同药物浓度DDP及在24、48、72 h三个时间点对A2780细胞的抑制率，不同药物浓度在不同时间点对A2780细胞的生长的抑制存在差异，72 h的抑制率明显高于24 h及48 h（P＜0.01），因此，以72 h浓度—抑制率曲线为标准，求得DDP的IC50为2.80 μg/mL。见图1。

2.1.2 不同药物浓度TAM对A2780细胞的抑制率 以MTT法检测不同药物浓度TAM在24、48、72 h三个时间点的细胞抑制率，结果显示，不同药物浓度在不同时间点对卵巢癌A2780细胞的生长表现出不同的抑制效果，其中，72 h的抑制率高于24 h及48 h（P＜0.05），因此，选择72 h浓度—抑制率曲线为标准，求得TAM的IC50为2.25×10-5mol/L（12.69 μg/mL）。见图2。

图1 不同浓度、时间顺铂作用于卵巢癌A2780细胞抑制率Fig.1 Inhibition of different concentration and duration of DDP on A2780 cells′proliferation

图2 不同浓度、时间他莫昔芬作用于卵巢癌A2780细胞抑制率Fig.2 Inhibition of different concentration and duration of TAM on A2780 cells′proliferation

2.2 DDP联合TAM对A2780细胞凋亡的形态学观察（Hoechst染色×200） 与对照组相比，给药组细胞出现胞浆浓缩，胞核致密浓缩，呈碎块状，颜色变白等形态学改变。于每幅图中随机选取5个视野，进行活细胞计数，结果显示，与对照组相比，给药组存活细胞数量显著减少（P＜0.01），且组间比较差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）（表1、图3）。

图3 顺铂联合他莫昔芬对细胞凋亡的形态学观察（Hoechst染色×200）Fig.3 Effect of DDP and TAM on cell apoptosis（Hoechst staining × 200）

表1 顺铂、他莫昔芬对细胞存活情况的影响Tab.1 Effect of DDP and TAM on cell survival ±s

表1 顺铂、他莫昔芬对细胞存活情况的影响Tab.1 Effect of DDP and TAM on cell survival ±s

注：A，顺铂组；B，他莫昔芬组；C，顺铂联合他莫昔芬组；D，正常对照组。**P＜0.01，与对照组相比；#P＜0.05，组间比较

组别 复孔A B C D 5 5 5 5细胞数目82.4±2.41**#88.6±4.93**#63.2±2.95**#193.8±5.63

2.3 流式细胞术检测各组处理对A2780细胞周期的影响 细胞周期分布发生明显改变，与对照组（4）相比，顺铂（A）及他莫昔芬（B）均使A2780细胞周期停滞于G0/G1期（P＜0.05，P＜0.01）（表2、图4）。

3 讨论

图4 顺铂、他莫昔芬对细胞周期的影响Fig.4 Effect of DDP and Cinobufacini on cell cycle

表2 顺铂、他莫昔芬对细胞周期的影响Tab.2 Effect of DDP and TAM on cell cycle ±s，%

表2 顺铂、他莫昔芬对细胞周期的影响Tab.2 Effect of DDP and TAM on cell cycle ±s，%

注：A，顺铂组；B，他莫昔芬组；C，顺铂联合他莫昔芬组；D，正常对照组。与对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01

组别A B C D n 3 3 3 3 G0/G1期67.48±4.85*72.3±4.16**39.37±5.21**58.37±2.65 S期+G2/M期32.52±4.85*27.7±4.16**60.63±5.21**41.63±2.65

约70%的卵巢癌发现时即为晚期，经过系统的手术分期或满意的减瘤术及辅助化疗，仍有70%的卵巢癌患者在2年内复发［9-10］，复发性卵巢癌对铂类化疗耐药，直接威胁到卵巢癌患者的生存。雌激素是卵巢癌的发病因素之一，研究表明，绝经后的卵巢癌患者体内雌激素水平较前明显增高［11］，雌激素与受体结合可促进细胞增殖，增强肿瘤细胞的侵袭及迁移。雌激素受体分α和β两个亚型，α受体可促进细胞有丝分裂，进而促进细胞生长，β受体恰好相反。使用α受体拮抗剂或者β受体激动剂处理卵巢癌细胞，可明显抑制细胞的生长［7］。NCCN推荐用于卵巢癌治疗的抗雌激素药物有两种，即选择性雌激素调节剂SERMs和芳香化酶抑制剂，常用的雌激素受体拮抗剂他莫昔芬及雷洛昔芬皆隶属于前者。他莫昔芬可与雌激素竞争受体结合形成复合物，改变雌激素受体的空间构型，进而抑制癌细胞活性，抑制其生长。本实验证实他莫昔芬能促进细胞凋亡，使肿瘤细胞周期停滞于G0/G1期，减少S期细胞的比例（P＜0.01），其对细胞周期的影响甚至优于顺铂（P＜0.05），形态学表现为胞浆及胞核浓缩，呈碎块状，颜色较正常细胞变白。他莫昔芬抑制A2780的基础实验效果可见一斑，而STASENKO等［12］的临床研究证实，他莫昔芬可延长难治性卵巢癌患者的无进展生存期（progression⁃free survival，PFS）。另一项随机对照研究，以82例口服他莫昔芬（40 mg qd）患者与156例行紫杉醇（80 mg/m2，每周）或阿霉素（40 mg/m2，每4周）化疗患者相比，PFS有统计学差异，但OS却无明显差别［13］。这显然为不能耐受化疗毒性反应的晚期或难治性卵巢癌患者提供了新的治疗选择。

当顺铂与他莫昔芬联合应用时，对细胞生长的抑制作用是毋庸置疑的（P＜0.01），本课题组发现，细胞周期的角度来看，肿瘤细胞S期比例上升，G0/G1比例减少，这显然提示顺铂联合他莫昔芬联合用药时其抑制细胞生长并不是单独的叠加效应。国内研究表明，顺铂可促进卵巢癌细胞表达雌激素受体，雌激素受体拮抗剂可减轻顺铂耐药［8］，究竟雌激素受体如何逆转顺铂耐药，其机制尚不清楚，余波澜等［14］的研究表明，雷洛昔芬的衍生物阿佐昔芬及其体内代谢产物去甲阿佐昔芬均可形成醌类代谢物，与谷胱甘肽相结合后能抑制谷胱甘肽转移酶的活性。由此推测，或可逆转顺铂耐药。然而，尚缺乏他莫昔芬减轻顺铂耐药的相关机制研究，需要广大学者进一步研究证实。