膀胱癌YAP表达及YAP对膀胱癌干细胞特性的影响

杨勇 姜睿

1西南医科大学附属医院泌尿外科（四川泸州 646000）；2遂宁市第一人民医院泌尿外科（四川遂宁629000）

膀胱癌（bladder cancer，BCa）是泌尿系统肿瘤中最常见的恶性肿瘤，近年来发病率和病死率都呈升高的趋势［1］。目前对浅表性膀胱癌多采取手术治疗的方式，但膀胱癌具有易复发、侵袭转移等特点，导致膀胱癌的治疗仍然是难点［2］。近年来膀胱癌干细胞的发现对于膀胱癌治疗提供新思路，靶向治疗膀胱癌干细胞对于有效根治膀胱癌至关重要，积极寻找调节膀胱癌干细胞特性的蛋白分子仍是目前研究热点。

Yes相关蛋白（YAP）是Hippo信号通路中的重要组成部分，在细胞内起到信号转导和转录共激活的作用［3］。Hippo⁃YAP信号通路是众多调节膀胱癌信号通路中一条重要的通路。YAP的异常表达与膀胱癌的发生发展、侵袭转移以及凋亡转移密切相关［4］。此外，YAP蛋白可以促进肿瘤干细胞干性相关基因活化，表明YAP在肿瘤干细胞中起到重要作用［5］，然而YAP与膀胱癌干细胞之间的关系仍未报道。

本研究通过比较正常膀胱上皮细胞及膀胱癌细胞YAP蛋白及mRNA表达差异，验证YAP在膀胱癌干细胞干性维持中的作用，为膀胱癌治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料 人正常膀胱上皮细胞SVHUC⁃1和人膀胱癌细胞株T24、253J、5637购自中国科学院昆明细胞库；DMEM培养基和RPMI 1640培养基购自美国Gibco公司；胎牛血清购自以色列BI公司；YAP过表达慢病毒购自上海吉凯基因化学技术有限公司；CD133单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，YAP抗体购自美国CST公司，Nanog抗体和Oct⁃4抗体购自美国abcam公司，GAPDH抗体购自沈阳万类生物科技有限公司。

1.2 细胞培养和慢病毒转染 细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM或RPMI1640培养基（青霉素100 IU/mL和链霉素100 IU/mL），置于37℃、体积分数为5%的CO2细胞培养箱中培养。2～3 d更换培养基，待细胞生长贴满培养皿，使用0.25%胰酶消化传代。T24细胞正常培养传代，YAP过表达慢病毒预实验感染确定T24细胞病毒转染MOI值。细胞计数按照1.0×105/孔接种于6孔板中，转染前用PBS清洗细胞，Complete Mdeium稀释polybrene至50 μg/mL，细胞加入polybrene和病毒，转染细胞48 h后使用2～3 μg/mL嘌呤霉素细胞筛选2～3周，荧光显微镜下检测荧光蛋白表达，Western blot和qRT⁃PCR检测YAP蛋白和mRNA表达情况。

1.3 平板克隆实验 取对数生长期的细胞以1 000个/孔接种于6孔板中，置于37℃、体积分数为5%的CO2培养箱中培养。5～7 d后显微镜下观察克隆形成情况并终止培养，弃去培养基，用PBS清洗，多聚甲醛固定20 min，PBS清洗后结晶紫染色30 min，缓慢冲洗后空气干燥，拍照并计数克隆数目。

1.4 Western blot分析 将处于对数期的细胞消化离心后，制成细胞悬液并进行细胞计数，以2×105/孔接种于6孔板中，置于37℃、体积分数为5%的CO2培养箱中培养，待细胞生长贴壁后取出并用4℃的PBS冲洗3次，每孔加入150 μL细胞裂解液（RIPA）裂解细胞，将刮下的细胞吸入离心管中涡旋震荡30 s，冰上静置10 min，于4℃离心机15 000 r/min高速离心15 min，收集上清液中的总蛋白。吸取5 μL上清液做蛋白定量，余下上清液中加入6×Loading buffer在沸水中煮沸10 min。每组吸取30 μg蛋白进行SDS⁃PAGE凝胶电泳分离，并转膜到PVDF膜，用含5%脱脂牛奶的TBST室温封闭1 h，加入一抗抗体4℃孵育过夜，经TBST洗膜液10 min×3次，加辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育1 h，再用TBST洗膜液10 min×3次，使用ECL化学发光法显影。目的蛋白通过与内参蛋白GAPDH标准化后得到相应比值。

1.5 qRT⁃PCR 对数期细胞进行消化离心后，细胞传代于6孔板中，待细胞生长至60%～70%时按照Trizol法提取RNA。提取的RNA吸取2 μL做RNA定量，同时通过反转录得到稳定的cDNA模板，反转录体系参照TaKaRa PrimeScriptTMRT Master Mix试剂说明书。检测使用TaKaRa SYBR@PrimixEx TaqTMⅡ反应体系，YAP上游引物序列为：5′⁃TAG⁃CCCTGCGTAGCCAGTTA⁃3′，下游引物序列为：5′⁃TCATGCTTAGTCCACTGTCTGT⁃3′。CD133上游引物序列为：5′⁃AGTCGGAAACTGGCAGATAGC⁃3′，下游引物序列为：5′⁃GGTAGTGTTGTACTGGGCCA⁃AT⁃3′。Nanog上游引物序列为：5′⁃TTTGTGGGC⁃CTGAAGAAAACT⁃3′，下游引物序列为：5′⁃AGGG⁃CTGTCCTGAATAAGCAG⁃3′。Oct⁃4 上游引物序列为：5′⁃CTGGGTTGATCCTCGGACCT⁃3′，下游引物序列 为 ：5′⁃CCATCGGAGTTGCTCTCCA⁃3′。 使 用GAPDH作为内参，上游引物序列为：5′⁃GGAGC⁃GAGATCCCTCCAAAAT⁃3′，下游引物序列为：5′⁃GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG⁃3′。mRNA 的表达水平采用2⁃△△Ct计算方法进行分析。

1.6 统计学方法 使用软件SPSS 18.0进行统计分析，计量资料以x±s表示，各组间均数比较采用独立样本t检验，多样本均数间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 正常膀胱上皮细胞及膀胱癌细胞系YAP表达情况 提取正常膀胱上皮细胞SVHUC⁃1及膀胱癌细胞系T24、253J、5637蛋白和mRNA，通过West⁃ern blot和qRT⁃PCR检测YAP表达变化，结果发现YAP蛋白（图1A）和mRNA（图1B）在膀胱癌细胞系T24、253J、5637相对正常膀胱上皮细胞SVHUC⁃1高表达。

图1 YAP蛋白及mRNA在正常膀胱上皮细胞及膀胱癌细胞系表达情况Fig.1 Expression of YAP protein and mRNA in normal bladder epithelial cells and bladder cancer cell lines

2.2 构建T24 YAP过表达细胞系 YAP蛋白在膀胱癌细胞系T24中相对253J和5637低表达，因此应用YAP过表达慢病毒感染T24细胞，构建YAP过表达细胞系，通过显微镜下观察（图2A），qRT⁃PCR和Western blot检验YAP mRNA（图2B）和蛋白（图2C和图2D）表达，验证成功构建YAP过表达T24细胞系。

图2 构建T24 YAP过表达细胞系Fig.2 T24 YAP overexpression cell lines were constructed

2.3 YAP过表达后膀胱癌细胞干细胞特性增强 提取T24过表达细胞系蛋白及mRNA，检测干细胞标志物CD133、Nanog和Oct⁃4表达，结果发现YAP过表达后干细胞标志物蛋白水平（图3A）和mRNA水平（图3B）均明显上调；过表达细胞系进行平板克隆实验，结果发现YAP过表达后平板克隆体积增大、数量增多（图3C和图3D），差异有统计学意义（P＜0.05）。

3 讨论

膀胱癌由于其高复发率和高侵袭转移能力，在泌尿系统肿瘤中严重影响人们的身体健康，成为导致患者死亡的重要原因。近年来，随着对肿瘤干细胞研究的深入，认为肿瘤干细胞具有类似正常组织干细胞的特点，肿瘤干细胞具有自我更新、自我增殖及多向分化的能力［6］。同时，膀胱癌干细胞的存在，对维持膀胱癌的发生发展、增殖及侵袭转移起着重要的作用。

肿瘤干细胞是一群具有自我更新、无限增殖和多向分化潜能的细胞群，在肿瘤的发生发展、复发转移以及多重耐药中发挥重要功能［7］。近年来泌尿系肿瘤干细胞相关研究取得了很显著的成果，YANG等［8］发现膀胱癌干细胞可能源自上皮基底干细胞的突变或非干细胞膀胱癌细胞的突变形成。目前膀胱癌干细胞表面分子标记物研究取得长足进步，如CD133、Nanog、Oct⁃4、Sox 2和ALDH1等［9］，本研究中采用CD133、Nanog和 Oct⁃4 进行检测，用于验证YAP改变对膀胱癌干细胞特性的影响。

图3 T24 YAP过表达干细胞特性增强Fig.3 YAP enhanced stem cell characteristics of bladder cancer cells

Hippo⁃YAP信号通路在肿瘤干细胞中对肿瘤的干性维持起着重要的作用［10］。YAP在人体正常组织如上皮、肌肉等中有一定量的表达，但是在恶性肿瘤如肝癌［11］、乳腺癌［12］、前列腺癌［13］和肾癌［14］等中，YAP的表达水平明显升高。有学者研究发现YAP在肝癌中是维持肝癌干细胞干性的主要调节因子［15］，在卵巢癌的研究中发现当抑制YAP后，卵巢癌干细胞的增殖能力和细胞克隆形成能力降低；当YAP过表达后卵巢癌干细胞的增殖能力和克隆形成能力加强［16］。然而，在膀胱癌中关于YAP对膀胱癌干细胞的影响却未见报道，本研究主要探讨YAP在膀胱癌干细胞中发挥的作用。通过Western blot和qRT⁃PCR发现YAP蛋白和mRNA在膀胱癌细胞系相对正常膀胱上皮细胞高表达，提示YAP可能是膀胱癌肿瘤发生的重要因素。慢病毒转染构建膀胱癌YAP过表达细胞系，并使用显微镜下观察荧光蛋白表达、Western blot和qRT⁃PCR检测YAP蛋白验证YAP过表达细胞系成功构建。为了验证YAP在膀胱癌干细胞特性中发挥的功能，本研究检测YAP过表达后干细胞标志物 CD133、Nanog和 Oct⁃4 表达改变，发现YAP 过表达后 CD133、Nanog和 Oct⁃4表达上调。同时使用平板克隆实验，发现YAP过表达后膀胱癌干细胞特性增强。

综上所述，YAP在膀胱癌细胞中表达上调，有可能是膀胱癌发生发展的重要分子，同时YAP水平改变对膀胱癌干细胞干性维持起到重要作用。本研究为膀胱癌靶向治疗提供新靶点，为提高膀胱癌的总体治疗水平和预后起到重要作用。