4-羟苯基维胺对瘢痕疙瘩成纤维细胞ProcollagenⅠ和MMP⁃1 mRNA表达的影响

南美兰 金玟言 金哲虎 金承龙

延边大学附属医院皮肤科（吉林延吉 133000）

瘢痕疙瘩（keloid）是人体皮肤创伤后异常修复的结果［1-2］，真皮部位以成纤维细胞为主的细胞过度增殖，合成大量胶原、纤维连接蛋白及糖蛋白，细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的合成与降解失去平衡，造成瘢痕形成异常［3］。

Ⅰ型胶原是ECM中最主要的成分之一，除自身的生理支持作用外，还可调节细胞的迁移与增殖，是创面愈合和瘢痕形成的关键因素。瘢痕疙瘩主要表现为Ⅰ型胶原特异性表达升高，在对治疗瘢痕疙瘩有效药物的深入研究中，大多离不开对胶原基因表达的影响。基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）及金属蛋白酶组织抑制物（tissue inhibitor of matrix metalloproteinase，TIMPs）是调节ECM成分合成和降解的重要分子［4-5］。基质金属蛋白酶-1（matrix metallo⁃protein⁃1，MMP⁃1）是MMPs家族的重要一员，在创伤愈合过程中对启动胶原的降解起着关键作用，是Ⅰ型胶原降解的关键酶。

4-羟苯基维胺（4⁃hydroxyphenyl⁃retinamide，4⁃HPR）是人工合成的全反式维甲酸，在体外实验中对多种恶性肿瘤细胞有较高的抗肿瘤活性，且毒性低于其他维甲酸类药物［6］。因瘢痕疙瘩具有肿瘤的生物学特性［7］，笔者推测 4⁃HPR也可用于瘢痕疙瘩的治疗。

前期研究中笔者发现，在人瘢痕疙瘩成纤维细胞中，4⁃HPR可以抑制Ⅰ型前胶原（typeⅠ pro⁃collagen，ProcollagenⅠ）及上调MMP⁃1蛋白的表达。为此，笔者本次进一步利用实时荧光定量PCR方法，探讨在RNA水平上，4⁃HPR的干预下对瘢痕疙瘩成纤维细胞产生的ProcollagenⅠ及MMP⁃1表达的影响。进一步明确4⁃HPR对瘢痕疙瘩成纤维细胞的作用机制，为瘢痕疙瘩的发病机制和治疗提供新的理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器 胎牛血清（Corning公司）、DMEM培养液（Corning公司）、Ⅱ型胶原酶（Gibco公司）、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ染料法荧光定量试剂盒（TaKaRa公司）、4⁃HPR（南京圣赛化工有限公司）、二甲基亚砜（Sigma公司）。CO2细胞培养孵育箱（Thermo Fisher Scientific公司）、倒置显微镜（Olympus公司）、PCR仪器（Life Technologies公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 人瘢痕疙瘩及正常真皮成纤维细胞的原代培养 成纤维细胞来源于瘢痕疙瘩组织（临床病理证实，已取得了患者知情同意，未接受局部外用药物、注射及放射治疗且无其他自身免疫性疾病及慢性器质性疾病）及正常皮肤组织（已取得了患者知情同意，而且所取标本的颜色和形态均正常，无瘢痕、炎症及其他病变）。将临床切取的标本在无菌条件下经漂洗、消毒，放入干燥的无菌培养皿中，切成1 cm×1 cm大小的碎片，放入含2 mL胰酶的离心管中4℃冷消化。冷消化24 h、热消化15～20 min后，遂将离心管内胰酶和组织一同倒入培养皿内，轻轻撕去表皮。将已去除表皮的皮片剪碎至1 mm×1 mm左右大小，加入2～3 mLⅡ型胶原酶，置入CO2恒温培养箱中，消化5～7 h。取上清液移至另一离心管中离心，去上清，加入原代培养基吹打混匀，转入到25 cm2的培养瓶中，放入CO2恒温培养箱中培养。次日观察，可观察到大量贴壁多角型细胞和黑色组织碎屑，碎屑周围有细胞爬出，且细胞呈长梭形，给细胞换液，用PBS液将碎屑冲洗干净，然后加入培养液在上述条件下继续培养细胞，每日换液，待细胞基本铺满瓶底后，且生长成致密单层时，可进行传代培养。取6～8代细胞用于实验。

1.2.2 药物配制 称取20 mg 4⁃HPR，加入1 mL DMSO溶解，-20℃避光保存备用，实验时用DMEM培养液稀释至相应浓度。

1.2.3 实时荧光定量PCR检测瘢痕疙瘩和正常成纤维细胞中ProcollagenⅠ和MMP⁃1 mRNA的表达水平 35 mm培养皿培养的细胞待80%～90%融合，消化、离心、彻底弃上清液，每孔加0.5～1.0 mL Trizol，混匀，室温放置5 min使细胞充分裂解，收集细胞和裂解液。每1 mL Trizol加0.2 mL氯仿，混匀，静置5 min抽提RNA，4℃，15 000 r/min，离心15 min。小心取水相RNA溶解层，加0.5 mL异丙醇，混匀后静置10 min，沉淀RNA，4℃，15 000 r/min，离心10 min。弃上清，加1 mL的70%乙醇洗涤，4℃，15 000 r/min，离心5 min。弃上清，开盖自然干燥后加入15～30 μL无RNase的DDW，溶解RNA。用超微量核酸定量仪直接测定核酸浓度，加2 μL RNase free DDW于点样板进行调零，加2 μL RNA原液测量，程序算出样品的260、280、230 nm的吸光度和RNA浓度、A260/A280及A260/A230，导出结果，标记、-80℃保存。按试剂盒说明书逆转录合成cDNA，目的基因ProcollagenⅠ、MMP⁃1和内参GAPDH基因同时进行PCR扩增。目的基因Pro⁃collagenⅠ、MMP⁃1和内参GAPDH基因的引物序列设计经基因库查询，均由上海Invitrogen有限公司合成，序列见表1。PCR扩增反应条件为：95℃预变性2 min，95℃变性22 s，58℃退火1 min，共40个循环。反应结束后采用2⁃△△CT法计算相对表达量，△Ct=Ct目的基因-Ct内参基因。

表1 引物序列、退火温度及产物长度Tab.1 Primersequences，annealing temperatures and products size of target genes

1.2.4 不同浓度4⁃HPR对瘢痕疙瘩纤维细胞中ProcollagenⅠ和MMP⁃1mRNA表达水平的影响对照组加入DMEM培养液，实验组分别以1、3、6 μmol/L的4⁃HPR溶液加入长满90%的瘢痕疙瘩成纤维细胞（饥饿24 h）中，分别作用24 h后，抽提RNA，进行相关检测。

1.3 统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件进行分析，样本比较用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 原代培养瘢痕疙瘩和正常皮肤成纤维细胞生长形态观察结果 成纤维细胞第5～8天开始见有少量细胞开始从组织中游出，并逐渐增多，直至第20～30天细胞可基本长满培养瓶底可进行传代。瘢痕疙瘩和正常皮肤成纤维细胞在倒置显微镜下观察，其形态上无明显差异。见图1。

图1 显微镜下成纤维细胞形态（×10）Fig.1 Morphology of fibroblasts observed under inverted micro⁃scope（× 10）

2.2 瘢痕疙瘩和正常成纤维细胞中ProcollagenⅠ和MMP⁃1mRNA的表达水平 结果示瘢痕疙瘩成纤维细胞中ProcollagenⅠmRNA表达明显高于正常皮肤成纤维细胞，差异有统计学意义（t=2.88，P＜0.05），而瘢痕疙瘩成纤维细胞中MMP⁃1mRNA表达低于正常皮肤成纤维细胞，且差异有统计学意义（t=2.22，P＜0.05）。见图2。

图2 成纤维细胞中ProcollagenⅠ和MMP⁃1 mRNA的表达Fig.2 The expression of Procollagen Ⅰand MMP⁃1 mRNA in fibroblasts

2.3 不同浓度4⁃HPR作用下瘢痕疙瘩成纤维细胞中ProcollagenⅠ和MMP⁃1 mRNA表达的比较在原代培养的瘢痕疙瘩成纤维细胞中，不同浓度的4⁃HPR药物处理组（实验组）中，随着浓度的增高ProcollagenⅠmRNA表达水平较对照组明显减少，即4⁃HPR对ProcollagenⅠmRNA表达呈明显的量效抑制，6 μmol/L时作用最强，且组间比较差异有统计学意义（t1=3.18，P1＜ 0.05；t2=3.87，P2＜0.05；t3=5.34，P3＜ 0.05）。而 MMP⁃1 mRNA 表达水平，随着4⁃HPR药物浓度的增高较对照组明显增加，6 μmol/L药物浓度时作用最强，组间比较差异有统计学意义（t1=5.18，P1＜ 0.05；t2=5.60，P2＜ 0.05；t3=7.86，P3＜ 0.01）。见图3。

图3 比较4⁃HPR不同浓度对瘢痕疙瘩成纤维细胞中ProcollagenⅠ和MMP⁃1 mRNA的表达Fig.3 Comparing the expression of ProcollagenⅠand MMP⁃1 mRNA in keloid fibroblasts in different concentrations of 4⁃HPR

3 讨论

瘢痕疙瘩是皮肤创伤的过度修复，是人类特有的一种良性皮肤纤维增殖性肿瘤，以细胞因子活性异常增强和产生大量的ECM为主要组织学特点，发病机制尚不完全清楚［8-9］。最显著的特征表现为胶原、纤维连接蛋白和蛋白糖原等ECM过度合成，降解减少，在局部大量沉积。

本研究结果表明，在原代培养的瘢痕疙瘩成纤维细胞中，ProcollagenⅠ的基因表达明显高于正常皮肤成纤维细胞（P＜0.05），而此类型前胶原属于原纤维化胶原类，ProcollagenⅠ基因表达升高导致其蛋白含量增多，可能是瘢痕疙瘩形成的原因之一，其作用可能与其他类型胶原的聚集以及胶原纤维与胞外基质作用有关。

近年来，胶原蛋白合成与降解间的失衡在瘢痕疙瘩发病机制中的作用引起重视，随之关于瘢痕疙瘩成纤维细胞中MMPs家族的检测也成为研究的热点课题。MMPs是一群因具有蛋白水解酶活性参与降解基底膜和ECM过程的家族。MMPs家族按作用底物的特异性和在细胞内的位置进行分类，已被发现的成员有5大类，均具有相对保守的基因结构和酶活性。MMP⁃1为其家族成员之一，它可以在创伤修复中Ⅰ型前胶原a1和a2链的特殊部位降解胶原，是降解胶原纤维最主要的基质金属蛋白酶。笔者在本次研究中，用实时荧光定量PCR方法分析MMP⁃1基因表达结果显示，体外原代培养的瘢痕疙瘩成纤维细胞中，其MMP⁃1 mRNA表达较正常皮肤成纤维细胞显著降低（P＜0.05），结果与张鹏等［10］、UCHID 等［11］及庞久玲等［12］结论相符，提示可能瘢痕疙瘩成纤维细胞自身存在着MMP⁃1转录及/或翻译水平的异常，致使瘢痕疙瘩成纤维细胞胞核、胞浆中MMP⁃1蛋白减少。

4⁃HPR是20世纪60年代美国开发合成的一种维甲酸衍生物。4⁃HPR已广泛应用于多种肿瘤的体内外研究，在临床试验中亦显示出良好的抗肿瘤作用，且人体对其有良好的耐受性［13-15］，是一种具有良好临床应用前景的肿瘤预防和治疗药物。瘢痕疙瘩表现出向周围正常皮肤组织侵袭性生长、无自愈倾向、单纯手术切除后容易复发、对放疗和化疗敏感等类肿瘤特性［16-19］，且研究［20］显示众多肿瘤相关基因及细胞因子在瘢痕疙瘩的发生、发展过程中发挥着重要作用，这些都提示在瘢痕疙瘩的治疗研究中可借鉴一些抗肿瘤的研究成果。本次研究，笔者用不同浓度的4⁃HPR处理原代培养的瘢痕疙瘩成纤维细胞，发现随着浓度的增高，实验组的ProcollagenⅠmRNA表达水平较对照组明显减少，且组间比较差异有统计学意义（P＜0.05），而实验组的MMP⁃1 mRNA表达水平较对照组明显增加，且组间比较差异有统计学意义（P＜0.05），与笔者前期在蛋白水平上4⁃HPR对ProcollagenⅠ及MMP⁃1影响的研究结果相一致［21］。

本次研究表明，4⁃HPR能阻断ProcollagenⅠmRNA表达或抑制其生物活性，且对MMP⁃1 mRNA有增强作用，达到实验性治疗瘢痕疙瘩的目的。而且，4⁃HPR具有浓度依赖性的降低瘢痕疙瘩成纤维细胞中的ProcollagenⅠmRNA及增加MMP⁃1 mRNA的表达，致使更有效地抑制成纤维细胞增殖，给瘢痕疙瘩的治疗带来较好的发展前景。