促红细胞生成素预处理对离体血管内皮细胞缺血再灌注模型中内皮型一氧化氮合酶表达的影响

王源江 李红戈 赵振强 王埮 李嫚 陈志斌

1海南医学院第一附属医院神经内科（海口 570102）；2华中科技大学同济医学院附属协和医院神经内科（武汉 430022）

近年来，急性缺血性脑卒中是全世界死亡的最常见原因，溶栓及血管内治疗是主要的治疗方法，但有部分患者治疗后导致脑缺血/再灌注损伤（I/R），使预后恶化，出现更严重的神经损伤和身体功能缺损或残疾［1-2］。脑缺血/再灌注损伤（I/R），包括有一氧化氮（nitric oxide，NO）自由基的产生、氧化应激作用、兴奋性氨基酸毒性作用及细胞内钙超载，促使大量神经递质释放，导致细胞凋亡的发生［3］。有研究结果表明，患者可通过缺血预适应（ischemic preconditioning，IPC）降低脑缺血/再灌注损伤（I/R）。IPC是体内最强大的保护机制，是一种多元性细胞防御现象，即预先反复短暂缺血可延缓或减轻组织后续缺血再灌注损伤的现象［4］。但临床上给予可能的脑梗死患者一次短暂性缺血进行预处理是不现实的。

随着对缺血耐受现象研究的深入，有研究［5-6］表明，促红细胞生成素（erythropoietin，EPO）可降低I/R，EPO是一种可被诱导的多功能细胞因子超家族成员，通过促进红系祖细胞分裂分化为成熟的红细胞，维持体内红细胞数量的动态平衡，从而对缺氧情况下的多种器官起到有保护作用。然而，德国相关研究报道，对成人中脑动脉中风后采取的随机、双盲、安慰剂对照分组，应用大剂量重组人红细胞生成素（recombinant human erythropoie⁃tin，rhEPO）治疗，此治疗对患者有效，但结果显示了rhEPO未引起红细胞的明显增多，是否通过对NOS表达的影响所致，目前研究太少，具体机制尚不清楚［7］。

在本研究中，通过培养血管内皮细胞（vascu⁃lar endothelial cells，VECs）并给予rhEPO预处理，建立离体缺血再灌注模型，检测细胞活力及内皮型一氧化氮合酶（eNOS）、半胱氨酸蛋白酶3（Caspase⁃3）的表达量，了解eNOS的表达情况，探讨其中可能的作用机制，以此评估促红细胞生成素预处理对血管内皮细胞的缺血再灌注损伤是否具有保护作用，并为将来的药物预处理预防缺血再灌注损伤寻找进一步依据。

1 材料与方法

1.1 主要药品及试剂 重组人促红细胞生成素（rhEPO）（沈阳三生制药），人脐静脉内皮细胞株（EA.hy926，华中科技大学同济医学院公共实验平台惠赠），碘化丙锭（DAPI）（美国Sigma），兔抗人eNOS、Caspase⁃3抗体（美国Santa Cruz）。

1.2 主要仪器 激光共聚焦显微镜FV1000（日本Olympus）。

1.3 细胞培养与处理 EA.hy926培养于含10%热灭活胎牛血清的DMEM高糖培养基，置于37℃、5%CO2及95%空气恒温培养箱中培养。单个人脐静脉内皮细胞时见细胞呈长梭形，融合生长时见细胞呈多角形为单层铺路石排列，待细胞融合至70%用于实验。

1.4 建立体外缺血再灌注损伤（I/R）模型 调整模拟缺血：去氧去糖，先以PBS洗细胞2遍，换Earle′s平衡盐溶液，置于厌氧培养箱中6 h，持续通入95%N2+5%CO2，流量为0.5 L/min；模拟再灌注：复氧复糖，将细胞培养液换为不含胎牛血清的DMEM高糖培养液，置于正常恒温培养箱内18 h［8］。

1.5 细胞分组和预处理方法 （1）正常对照组：正常条件培养48 h；（2）单纯I/R组：正常条件培养24 h，后模拟I/R；（3）rhEPO预处理组：含不同浓度（5、10、20 U/mL）rhEPO的培养基中培养24 h，后模拟I/R。

1.6 MTT比色法测细胞存活率 将对数生长期VECs分别按5×103个/孔接种于96孔板，接种后培养24 h，按分组处理细胞。处理结束后每孔加5 mg/mL MTT 20 μL孵育4 h，后加入150 μL DMSO，振荡15 min后酶标仪测定490 nm处吸光度值，实验重复3次。

1.7 Western blot检测 取对数生长期，按分组处理后收集细胞，提取细胞总蛋白。测定蛋白浓度，按上样量20 μg蛋白/孔于SDS⁃PAGE凝胶进行电泳分离，再转至NC膜，并用5%BSA室温封闭1 h，一抗4℃孵育过夜，TBST清洗后加二抗室温孵育1 h，然后ECL显影，实验重复3次。

1.8 免疫荧光检测 取对数生长期的VECs，接种于置有盖玻片的12孔培养板中，细胞贴壁后按组别给予处理，后3.5%的多聚甲醛固定10 min，0.2%Triton X⁃100冰上破膜15 min，3%牛血清蛋白封闭抗原30 min，一抗4℃孵育过夜，次日予FITC二抗孵育1 h，DAPI染核后在激光共聚焦显微镜下拍照，实验重复3次。

1.9 统计学方法 采用SPSS 20.0版软件进行统计学分析，如为正态分布其方差齐，则采用单因素方差分析，两两比较用LSD法；如不服从正态分析或方差齐性，采用多个样本秩和检验（Kruskal⁃Wallis，H检验），两两比较采用Wilcoxon符号秩和检验。假设检验采用双侧检验，α=0.05。

2 结果

2.1 细胞活力检测结果 对照组、I/R组和各rhE⁃PO预处理组的细胞存活率分别为100、38.2±1.5、57.1±5.8、67.6±6、74.5±6.9。见图1。经Kruskal⁃Wallis检验，差别有统计学意义（H=23.077，P＜0.001），各组表达水平经两两比较，正常对照组、各rhEPO预处理组与I/R组表达水平差异均有统计学意义（P＜0.05）；各rhEPO预处理组组间表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）。

图1 各组血管内皮细胞存活率Fig.1 The cells survival rate of VECs in each group

2.2 eNOS和Caspase⁃3蛋白含量检测

2.2.1 eNOS蛋白含量 对照组、I/R组和各rhEPO预处理组的eNOS蛋白水平分别为0.34±0.021、0.15 ± 0.034、0.51 ± 0.0304、0.64 ± 0.042、0.79 ±0.230。见图2。经Kruskal⁃Wallis检验，差异有统计学意义（H=23.077，P＜0.001）。各组表达水平经两两比较，正常对照组、rhEPO预处理组与I/R组表达水平差异均有统计学意义（P＜0.05），各rhEPO预处理组组间表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）。

图2 各组VECs的eNOS表达水平比较Fig.2 Comparison of eNOS protein expression in VECs of rates in each group

图3 蛋白印迹法（Western⁃blot）检测细胞中内皮型一氧化氮合酶（eNOS）蛋白水平Fig.3 Detected protein level of eNOS in cell by Western⁃blot

2.2.2 Caspase⁃3蛋白含量检测 对照组、I/R组和各rhEPO预处理组的Caspase⁃3蛋白分别为0.21±0.024、0.79 ± 0.0624、0.65 ± 0.0349、0.53 ± 0.032、0.44 ± 0.0314。见图4、图5。经 Kruskal⁃Wallis检验，表达水平差异有统计学意义（H=23.077，P＜0.001）；各组表达水平经两两比较，正常对照组与I/R组表达水平差异有统计学意义（P＜0.05），各rhEPO预处理组与I/R组表达水平差异有统计学意义（P＜0.05），各rhEPO预处理组间表达水平差异有统计学意义（P＞0.05）。

图4 各组VECs的Caspase⁃3表达水平比较Fig.4 Comparison of Caspase⁃3 protein expression in VECs of rates in each group

图5 蛋白印迹法（Western⁃blot）检测细胞中半胱氨酸蛋白酶3（Caspase⁃3）蛋白水平Fig.5 Detected protein level of Caspase⁃3 in cell by Western⁃blot

2.3 激光共聚焦显微镜检测细胞eNOS和Cas⁃pase⁃3的表达 I/R组细胞的eNOS表达量较正常对照组细胞降低，而各rhEPO预处理组提示eNOS表达较I/R组细胞明显增强，且荧光强度随着rhE⁃PO的浓度改变；Caspase⁃3的表达量则呈现完全相反的趋势，I/R组细胞的表达量较正常对照组细胞明显增强，而各rhEPO预处理组则出现下降，下降趋势随着rhEPO的浓度改变。见图6、7。图中的B组血管内皮细胞胞浆中绿色荧光较A组明显减弱，C、D、E这3组不同浓度rhEPO预处理后再模拟缺血再灌注后血管内皮细胞胞浆中绿色荧光较B组明显增强。见图6。

血管内皮细胞胞浆中绿色荧光较A组明显增强，C、D、E这3组不同浓度rhEPO预处理后再模拟缺血再灌注后血管内皮细胞胞浆中绿色荧光较B组明显减弱。见图7。

3 讨论

缺血性再灌注后导致脑缺血/再灌注损伤，可激活nNOS产生一氧化氮（NO）［9］。NO是机体内重要的信使分子和效应分子，是神经信号传递和血管舒张等过程的内源性介质之一，对脑血管的神经性支配的调节，在维持神经元功能的完整性及脑血流恒定方面发挥重要作用［10-12］。NOS是一类含血红素，包括分布在神经元的神经型一氧化氮合酶（nNOS）；分布在肝细胞、巨噬细胞、单核细胞、星形胶质细胞和小胶质细胞的诱导型一氧化氮合酶（iNOS）；分布血管内皮细胞的内皮型一氧化氮合酶（eNOS）［13］。

多项研究表明，eNOS、EPO对脑血管均能起保护作用。NO的产生是诱导缺血耐受力（ischemic tolerance，IT）的关键因素，主要保护作用机制是，在脑缺血极早期（＜2 h），Ca2+内流或肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）通过PI3K/Akt通路诱导eNOS活性增强，所产生的NO可以激活鸟苷酸环化酶（GC）提高环磷酸鸟苷（cGMP）水平，扩张脑血管增加缺血区域血流、调控血小板聚集进而提供保护作用［14-16］。脑梗死早期（2～6 h）nNOS受Ca2+内流的诱导过度表达，而脑缺血再灌注约6 h后iNOS受多种细胞因子、内毒素及氧自由基（ROS）诱导，由DNA转录调节表达，依赖细胞外L-精氨酸（L⁃Arg）的量，24 h达高峰，48 h开始下降，再灌注可使iNOS产生过量的NO，并与“呼吸爆发”后的大量ROS结合成ONOO-，降解为（OH-）及NO2损伤细胞，而且有实验表明iNOS的激活会损伤eNOS生成NO的能力［17-19］。

EPO是HIF⁃1a的下游靶基因之一，脑缺氧时HIF⁃1a被激活，释放EPO，从而发挥脑的作用［20］。其保护作用主要有：（1）上调抗氧化酶表达，增强抗氧化酶活性，减少氧自由基产生；（2）减少血管内皮细胞凋亡；（3）通过EPOR直接作用于Ca2+通道，使之去极化抑制凋亡相关蛋白Caspase⁃3的合成而抗凋亡；（4）上调抗氧化酶的表达，增强CAT、SOD和GSH⁃PX等抗氧化酶的活性，并下调氧自由基产生，抑制平滑肌细胞内iNOS表达，减少NO的过量产生［21-22］。其在脑组织内与EPOR（EPO受体）结合后形成同源二聚体，致蛋白酪氨酸激2（Janus⁃tyrosine kinase⁃2，JAK⁃2）自身磷酸化激活［23］。而MARCEL等报道的氨基甲酰化EPO（CEPO）是一种没有升血活性的神经保护因子，在离体对脑中风、脊髓压缩、糖尿病神经病变、实验性自身免疫性脑脊髓炎有神经保护作用［24］。

德国的小样本量的成人中脑动脉中风后应用大剂量rhEPO治疗临床试验样本例数及范围有限，CEPO作为新的EPO结构体，其结构改变后神经保护效果与rhEPO之间是否存在差异，机制尚未明确。

故在本研究中，通过不同浓度rhEPO预处理后对试验组内皮细胞eNOS蛋白表达是否影响，明确EPO是否可降低凋亡蛋白Caspase⁃3合成，增加eNOS蛋白表达从而达到保护作用。实验结果显示，不同试验组间细胞存活数量、Caspase⁃3、eNOS的变化，可知rhEPO预处理可提高缺血再灌注损伤下内皮细胞的存活率，而且其保护作用随rhE⁃PO浓度改变而变化，结合NO和EPO的激活作用机制和Lipton等提出的NO氧化还原状态的不同作用，由此我们认为给予rhEPO预处理结合Epo⁃R致JAK2磷酸化直接激活PI3K/Akt通路而提高eNOS表达水平并延长其表达时间，通过以下途径保护细胞：（1）由eNOS生成的NO氧化态NO+可以使⁃SH发生S-亚硝酰化致NMDA受体通道活力下降，阻止Ca2+内流以避免出现或减轻细胞钙超载；（2）在体内条件下可通过其产物NO氧化态NO+扩张脑组织内丰富的侧枝循环，改善局部脑血流，减少了iNOS的激活，降低缺血再灌注损伤诱导的氧化应激快速级联反应的程度，提高血管内皮细胞对缺血再灌注损伤的耐受力。

本研究完善rhEPO作用机制的研究，从不同途径比较CEPO与rhEPO神经保护效果。本实验中体外缺血再灌注模型为成熟的模型，从MTT结果和蛋白印迹检测结果可知，Caspase⁃3的诱导和细胞凋亡效果明确，所以未检测cleaved⁃Caspase⁃3，除此之外，cleaved⁃Caspase⁃3由Caspase⁃3切割活化而来，两者间的表达水平变化目前尚无固定比例。细胞免疫荧光检测中由于进行固定、破膜、孵育、反复洗涤等步骤，检测片子上所存留的细胞数量并不能代表真实的数量，但仍有一定的指导、参考作用，对EPO在预防神经损伤方面的大范围预防性应用具有重大意义。在下一步研究中，将研究并完善如何检测cleaved⁃Caspase⁃3显示凋亡程度，并进行分析。