组蛋白去乙酰化酶4在异氟烷预处理抑制脂多糖诱导的炎症反应中的作用

郭欣莹 郑彬 阮祥才

广州医科大学附属市第一人民医院麻醉科（广州 510180）

异氟烷，作为临床上广泛使用的吸入麻醉药物，具有免疫调节作用。有研究［1-2］表明，异氟烷可以降低中性粒细胞的活性，抑制巨噬细胞释放细胞因子［3］，减弱自然杀伤细胞对干扰素的反应［3-4］等。异氟烷预处理，是一种与缺血预处理（ischemic preconditioning，IPC）类似的现象，具有抗炎和保护缺血/再灌注损伤效应［5］。在围手术期，由麻醉、手术等刺激而引起的炎症反应是常见的临床现象。研究［4］发现，在脂多糖诱导炎症反应，异氟烷预处理能降低单核⁃巨噬细胞释放炎症因子，并有效改善急性呼吸窘迫综合征和急性肺损伤大鼠的症状［6-7］。然而，异氟烷预处理对机体炎症反应的调节机制仍不明确。

近年来研究［8］表明，疾病的发生、发展、环境因素（如饮食习惯、药物、吸烟）都能引起表观遗传学机制的改变。而异氟烷等吸入麻醉药的免疫调节作用与表观遗传学修饰之间具有密切的关系。其中，异氟烷可对组蛋白的乙酰化修饰和组蛋白去乙酰化酶产生不同程度的影响，进而影响其对靶基因的转录过程，最终造成神经炎症或认知功能发育障碍［9-11］。有相关研究［12-13］表明，HDAC4在组蛋白乙酰化修饰调控炎症反应的发生、发展过程中起重要调控作用。在血管平滑肌细胞中，TNF⁃α能促进HDAC4核转位，激活ROS介导NF⁃κB信号通路，从而调节血管炎症。而利用siRNA技术在血管平滑肌细胞内干扰HDAC4的表达，能抑制TNF⁃α介导的单核细胞粘附、VCAM⁃1表达、NF⁃κB信号通路和ROS的产生，从而抑制高血压的发生和发展［13］。因此笔者推测HDAC4可能是异氟烷预处理调节炎症反应过程中的重要靶点之一。

本研究拟观察内毒素刺激对人单核细胞HDAC4核转位的影响，以及异氟烷预处理的相应效果，将有助于明确异氟烷预处理抗炎和HDAC4核转位的关系和初步机制，为围手术期吸入麻醉药的合理使用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料 THP⁃1细胞购自美国模式培养物集存库（ATCC）。RPMI1640培养基和胎牛血清购自美国Gibco公司。脂多糖（LPS）购自美国Sigma公司。异氟烷（ISO）购自深圳市瑞沃德生命科技有限公司。核浆蛋白提取试剂盒购自美国Thermo公司。MTS法细胞增殖与毒性检测试剂盒购自美国Promega公司。人TNF⁃α Quantikine ELISA试剂盒购自美国R&D Systems公司。兔抗人HDAC4抗体购自美国CST公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 THP⁃1细胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基培养。按需要把处于对数生长期的细胞接种到不同体积的培养皿中，置于37℃，5%CO2培养箱中培养。

1.2.2 细胞分组 把处于对数生长期的THP⁃1细胞随机分为不同的处理组。将THP⁃1细胞放置于自制的密封的吸入麻醉药设备中进行预处理。异氟烷预处理组的气体条件设置为异氟烷1.5%、5%CO2、21%O2、其余用N2的混合气体填充。对照组使用含有 5%CO2、21%O2、74%N2的混合气体进行处理。根据相应组别设置异氟烷预处理时间。之后在相应组别中加入脂多糖（400 ng/mL）并置于37℃、含5%CO2的细胞培养箱中处理18 h。

1.2.3 ELISA检测细胞上清TNF⁃α的变化 将处理后的THP⁃1细胞用3 000 r/min，4℃离心15 min后提取上清。采用ELISA试剂盒检测细胞上清中TNF⁃α的变化。首先根据说明书方法配置不同浓度的标准品制作标准曲线，然后根据测定的OD值算出相应的TNF⁃α浓度。

1.2.4 Western blot检测蛋白的表达 根据核浆蛋白提取试剂盒说明书，分别提取细胞的核蛋白和胞浆蛋白。采用Western blot检测HDAC4的表达。BCA法测定蛋白浓度。蛋白样品分别设置相关参数进行电泳和转膜实验。转膜后的PVDF膜用5%的脱脂牛奶封闭1 h。将一抗稀释成一定的浓度（1∶1 000），并加入PVDF膜上，4℃摇床过夜。第二天用相应二抗（1∶5 000），在室温孵育1 h。用ECL显影液进行显影。用ImageJ软件计算目的条带的灰度值进行统计分析。

1.2.5 MTS检测细胞活力的改变 取100 μL已处理和未处理的THP⁃1细胞培养液到96孔板中，再在每个孔中加入20 μL MTS试剂。置于37℃、含5%CO2培养箱中孵化2 h。取出后用562 nm比色，记录所测样品的吸光值。分别取得已处理和未作处理的细胞的吸光度作比值。

1.2.6 统计学方法 采用GraphPad Prism7对结果进行统计学分析，数据以均数±标准差表示，多组之间总体均数比较使用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度的脂多糖对TNF⁃α的释放和细胞活力的影响 脂多糖浓度为400 ng/mL时，细胞上清中TNF⁃α的浓度达到最高（P＜0.01）（图1A）。同时，结果显示脂多糖浓度为1 500 ng/mL时，细胞活力明显降低（P＞0.05）（图1B）。因此，笔者选取脂多糖浓度为400 ng/mL作为后续实验的剂量。

图1 各组细胞中TNF⁃α释放和细胞活力的变化Fig.1 The releaes of TNF⁃α and cell viability in each group

2.2 不同的异氟烷预处理时间对脂多糖诱导的TNF⁃α的释放和细胞活力的影响 与0 min的异氟烷预处理相比，6和12 h的异氟烷预处理能有效抑制TNF⁃α的释放（P＜0.01）（图2A）。12 h的异氟烷预处理后再加入脂多糖（400 ng/mL）刺激THP⁃1细胞18 h，细胞活力明显降低（P＜0.05）（图2B）。因此笔者选取6 h的异氟烷（1.5%）预处理作为后续实验的处理时间。

2.3 异氟烷预处理能抑制脂多糖诱导的炎症因子释放 与对照组相比，LPS组能明显促进细胞分泌炎症因子，TNF⁃α 的表达增加2.31倍（P＜0.01）。与LPS组相比，ISO+LPS组内THP⁃1细胞释放的TNF⁃α出现一定程度的降低（P＜ 0.05）（图3）。

图2 各组细胞中TNF⁃α释放和细胞活力的变化Fig.2 The releaes of TNF⁃α and cell viability in each group

图3 各组细胞中TNF⁃α释放和细胞活力的变化Fig.3 The releaes of TNF⁃α and cell viability in each group

2.4 异氟烷预处理能抑制脂多糖诱导HDAC4核转位 与对照组相比，LPS组的核蛋白内HDAC4明显增加（P＜0.01），但胞浆蛋白的HDAC4降低（P＜0.05）；而ISO组的胞浆蛋白较对照组中HDAC4表达增高。LPS+ISO组的核蛋白较LPS组内HDAC4表达显著降低（P＜0.01），胞浆蛋白的HDAC4增加（P＜ 0.05）（图4）。

图4 各组细胞中HDAC4表达变化Fig.4 The expression of HDAC4 in each group

3 讨论

异氟烷作为目前临床上被广泛使用的吸入麻醉药之一，在全身麻醉的诱导及维持过程中占据主导地位。有研究表明异氟烷预处理能抑制脂多糖诱导的炎症因子的释放。CHUNG等［14］发现，异氟烷预处理对脂多糖诱导的急性肺损伤起保护作用，它可以通过抑制NF⁃κB信号通路的激活，从而减少炎症因子TNF⁃α，IL⁃6和IL⁃1β的释放。我们的研究结果发现，在脂多糖诱导的炎症反应中，1.5%异氟烷预处理6 h能有效抑制炎症因子的释放。这些结果表明，异氟烷预处理确实具有抑制炎症因子释放的能力。因此，在围手术期，严重外伤、重大手术创伤、休克、感染后的病人使用异氟烷预处理可能具有潜在的临床意义。

炎症反应属于临床上常见的一个病理生理过程，有多种机制参与，现有广泛研究证实染色质介导的表观遗传调节在其中发挥较为关键的作用［15］。其中组蛋白乙酰化修饰是表观遗传学中一种常见形式，它主要由HATs和HDACs共同调节。而特定的组蛋白去乙酰化酶（HDACs）能与不同的信号通路相互作用并调节其生物活性。在糖尿病肾病大鼠模型中，WANG的团队［15］分别检测了HDAC1⁃11在肾脏中的表达，发现HDAC4和HDAC5在肾脏中表达明显增高，而其中HDAC4与NF⁃κB信号通路的激活有密切关系，并且发现丙戊酸能通过抑制HDAC4的表达，从而抑制组蛋白H3和H4的乙酰化，导致TNF⁃α等炎症因子减少起抗炎作用，从而对肾脏起保护作用［15-16］。值得注意的是，IIa类HDACs包括HDAC4、HDAC5和HDAC7，其中HDAC4在巨噬细胞中高度表达［17］。因此，笔者猜测HDAC4在异氟烷预处理抑制炎症因子的过程中起重要作用。笔者分别提取THP⁃1细胞的核蛋白、胞浆蛋白和总蛋白检测HDAC4的表达，发现：在脂多糖诱导的炎症反应中，THP⁃1细胞中核蛋白HDAC4明显增加，而胞浆蛋白中HDAC4减少；但异氟烷预处理后的THP⁃1细胞中核蛋白的HDAC4明显降低，而胞浆蛋白中HDAC4增加；同时总蛋白的HDAC4表达无明显变化。有研究［15］表明，高糖能诱导足突细胞中HDAC4进入细胞核，抑制STAT1启动子区域的乙酰化，从而调节炎症凋亡等过程。因此，笔者认为在脂多糖诱导的炎症反应中，THP⁃1细胞中的HDAC4核转位激活炎症相关的信号通路，从而促进下游炎症因子的释放；相反，异氟烷预处理后再给予脂多糖刺激THP⁃1细胞，则诱导HDAC4从细胞核到胞浆，抑制炎症相关的信号通路。在整个过程中，HDAC4的表达并无明显改变，异氟烷预处理是通过诱导HDAC4在胞核⁃胞浆移动，从而调节炎症因子的释放。本研究的创新点在于首次从组蛋白乙酰化修饰的角度探讨异氟烷预处理抑制炎症因子的潜在机制，但仍需进一步实验明确不同的HDACs在异氟烷预处理中的作用。

综上所述，本研究证明了HDAC4在异氟烷预处理抑制炎症因子中的作用。结果提示，异氟烷预处理通过抑制HDAC4核移位，从而抑制HDAC4介导的炎症因子释放。但目前，关于HDACs在异氟烷预处理中的作用研究仍处于起步阶段，其对生物学行为调控的具体机制仍未完全阐明，仍需进一步的实验研究。