褐藻多糖硫酸酯对1-甲基4-苯基吡啶离子损伤的MN9D细胞内氧化应激及组织蛋白酶D-单克隆凋亡相关蛋白的作用

梁志刚，孙旭文，李敏，窦连伟，陶曼丽，王晓民

·论著·

褐藻多糖硫酸酯对1-甲基4-苯基吡啶离子损伤的MN9D细胞内氧化应激及组织蛋白酶D-单克隆凋亡相关蛋白的作用

梁志刚，孙旭文，李敏，窦连伟，陶曼丽，王晓民

目的 探讨褐藻多糖硫酸酯(FUC)对1-甲基4-苯基吡啶离子(MPP+)损伤的MN9D细胞内氧化应激及组织蛋白酶D(CatD)单克隆凋亡相关蛋白的作用。方法 采用100 mol/L MPP+损伤MN9D细胞制备帕金森病(PD)细胞模型。观察FUC预处理后PD细胞模型的细胞存活率。采用荧光检测法测定细胞内超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽还原酶(GSH)抑制率。采用Western blot法检测CatD、自噬相关蛋白(LC3-Ⅱ)及Bax蛋白表达。结果 与MPP+组比较，1×10-6、10-5、10-4mol/L FUC预处理细胞存活率均显著升高(均P<0.01)。与对照组比较，MPP+组SOD、GSH抑制率显著降低(均P<0.05)。与MPP+组比较，FUC预保护组及SEL预保护组SOD、GSH抑制率显著升高(均P<0.01)。FUC预保护组与SEL预保护组SOD、GSH抑制率比较差异无统计学意义。MPP+组CatD蛋白、LC3-Ⅱ蛋白及Bax蛋白水平表达显著高于对照组(均P<0.001)。FUC预保护组、SEL预保护组及CatD抑制剂组CatD蛋白、LC3-Ⅱ蛋白及Bax蛋白水平显著低于MPP+组(均P<0.001)。FUC预保护组、SEL预保护组及CatD抑制剂组CatD蛋白、LC3-Ⅱ蛋白及Bax蛋白水平差异无统计学意义。结论 FUC对PD细胞模型有保护作用，其机制可能为保护细胞溶酶体，抑制CatD-Bax的表达，抗氧化应激，抑制细胞凋亡。

褐藻多糖硫酸酯；MN9D细胞；1-甲基4-苯基吡啶离子；氧化应激；细胞凋亡

帕金森病(PD)是一种常见神经变性病，其发病机制尚未阐明[1]。已有研究[2]证实，氧化应激、线粒体功能障碍介导的神经细胞凋亡在退行性疾病发生、发展中起到了重要作用。组织蛋白酶D(CatD)在线粒体水平之前即参与了细胞凋亡的调控。褐藻多糖硫酸酯(FUC)是海洋生物褐藻提取的具有抗氧化、抗凝及抗老化的多糖，与葡胺聚糖(GAG)有类似结构[2]。有研究[3]表明，FUC对Alzheimer’s病模型具有神经保护作用。本研究小组前期实验[4]结果显示，FUC对PD模型有保护作用。本研究采用1-甲基4-苯基吡啶离子(MPP+)损伤小鼠中脑多巴胺能神经元细胞系MN9D细胞，探讨FUC与氧化损伤、CatD-Bax轴的关系，寻找其干预氧化应激诱导神经元凋亡的机制及作用靶点。

1 材料与方法

1.1 材料及分组 MN9D细胞购买于中国医学科学院细胞室，于我中心实验室保存，分为对照组、MPP+组、FUC预保护组、司雷吉兰(SEL)预保护组及CatD抑制剂组。

1.2 主要试剂 DMEM/F12培养基为美国GIBCO BRL公司产品，新生牛血清(NCS)为奥地利PAA公司产品，胎牛血清为GIBCO公司产品，MPP+为美国SIGMA公司产品。FUC购自中国生物检验中心，纯度99.8%；阳性对照药物选择单胺氧化酶抑制剂司雷吉兰是目前临床上常用的治疗药物(SEL)[5]，有效药物浓度10 μmol/L。MTS细胞活力测定试剂盒为PROMAGE公司，超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽转移酶(GSH)荧光检测试剂盒购自CELL BIOLABS公司；小鼠单克隆凋亡相关蛋白(Bax)、CatD、自噬相关蛋白(LC3-Ⅱ)抗体及甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)购自SIGMA公司。其他试剂均为分析纯，购自SIGAMA公司。

1.3 方法

1.3.1 MN9D细胞培养及MPP+诱导的MN9D细胞损伤的模型建立 从液氮罐中取出冻存MN9D细胞管，迅速放入37℃水浴中，令其尽快融化。1 000 r/min离心5 min后弃上清，沉淀物用DMEM/F12+10%NCS培养液混悬，吸出细胞悬液，用适量培养液稀释后，转入无菌培养瓶37℃、5% CO2细胞培养箱培养，次日更换培养液。培养48 h进入指数生长期后进行传代培养并进行试验。将细胞接种于Poly-L-lysine包被的96孔板，接种密度为1×105/ml，每孔接种体积为100 μl。细胞稳定24 h后更换含5% NCS的DMEM/F12培养基。根据本研究小组既往研究[6]结果，选用100 μmol/L的MPP+损伤MN9D细胞24 h制备PD细胞模型，对照组加入相同体积的生理盐水。MN9D细胞接种于Poly-L-lysine包被的96孔板，接种密度为1×105/ml，每孔接种体积为100 μl。利用MTS试剂盒检测细胞存活率，筛选确定FUC最佳保护浓度。将MN9D细胞接种于Poly-L-lysine包被的96孔板，细胞稳定24 h后更换含5%NCS的DMEM/F12培养基，分别采用1×10-8～10-4mol/L梯度浓度的FUC的培养基预处理MN9D细胞1 h后，加入100 μmol/L MPP+共孵育24 h。吸取培养液，更换含5% NCS的DMEM/F12培养基，96孔板内每孔加入10 μl MTS试剂细胞培养箱孵育1 h后，采用酶标仪检测光密度(OD)值，比较MPP+组及不同浓度FUC组的细胞存活率，以确定FUC最佳保护浓度。将MN9D细胞接种于Poly-L-lysine包被的6孔板，接种密度为1×105/ml，每孔接种体积为0.5 ml。细胞稳定24 h后更换含5% NCS的DMEM/F12培养基，FUC预保护组、SEL预保护组及CatD抑制剂组分别加入最佳保护浓度的FUC、SEL 10 μmol/L及CatD抑制剂——pepstatinA 10 μmol/L孵育1 h后，加入100 μmol/L的MPP+共孵育。

1.3.2 MN9D细胞SOD、GSH活力的检测及细胞形态的观察 按上述方法处理12 h后按照试剂盒操作说明步骤，应用荧光检测仪检测对照组、MPP+组、FUC预保护组、SEL预保护组的MN9D细胞内SOD、GSH活力，以抑制率(%)表示，抑制率越高，细胞活性越高；24 h后采用倒置相差显微镜观察细胞形态变化，随机取4个视野，100倍率，观察各组细胞形态及细胞数目。

1.3.3 MN9D细胞相关蛋白水平的检测 按上述方法处理3 h后采用Western blot法检测对照组、MPP+组、FUC预保护组、SEL预保护组及CatD抑制剂组的LC-3Ⅱ、CatD蛋白表达，共孵育6 h后检测Bax蛋白表达。将培养6孔板中的各组细胞加入99 μl蛋白裂解液及1 μl鸡尾酒蛋白酶抑制剂，冰上裂解5 min，用细胞刮收集细胞，移液器把裂解物移到艾本德管中，裂解产物超声处理3次。冰浴中静置30 min，12 000 r/min，4℃，离心5 min。将上清移入另一艾本德管中，弃去沉淀。95℃变性5 min，存于-20℃冰箱中待用。灌制10%～12%分离胶和5%积层胶，样品置于凝胶加样缓冲液中，电泳槽中充满电泳缓冲液，加入60 μg样品后连接电源。采用80 V处理20 min，再调整为120 V处理80～100 min，直至溴酚蓝到达分离胶底部。取出凝胶进行转膜，将凝胶和硝酸纤维素膜装入标有正、负极的转膜夹板中：从阴极侧开始，依次放置海绵垫片、3层滤纸、凝胶、硝酸纤维素滤膜、3层滤纸、海绵垫片，排出气泡，扣紧转膜夹板，置于含有电泳转移缓冲液的转移电泳槽中(100 V，60 min)。取出硝酸纤维素滤膜，PBS洗膜10 min，置于含5%脱脂奶粉PBS溶液中封闭，室温轻摇1～2 h，各组细胞分别加入含5%脱脂奶粉PBST稀释的小鼠抗Bax(1∶500)、CatD(1∶2 000)、LC3-Ⅱ(1∶2 000)并加入用于作为内参的小鼠抗GAPDH抗体(1∶10 000)，4℃孵育过夜。次日取出后室温放置30 min，PBST洗膜3次，每次10 min，加入IRDye800(1∶10 000)标记羊抗小鼠二抗，室温轻摇1 h，PBST洗膜3次，每次10 min，用PBS洗去膜上残留的Tween-20。采用Odyssey红外成像系统对膜进行扫描测蛋白条带OD值，检测CatD蛋白、LC3-Ⅱ蛋白及Bax蛋白WB条带OD值；每组重复4次，取均值。

2 结 果

2.1 不同浓度的FUC对PD细胞模型中MN9D细胞存活率的影响 MPP+组细胞存活率为49%，1×10-8～10-4mol/L FUC组细胞存活率分别为50%、52%、54%、62%、71%。与MPP+组比较，1×10-6、10-5、10-4mol/L FUC预处理细胞存活率均显著升高(均P<0.01)，10-8及10-7mol/L FUC预处理细胞存活率差异无统计学意义。其中10-4mol/L FUC与保护MN9D细胞存活率最高，故为FUC最佳保护浓度。

2.2 各组间MN9D细胞SOD、GSH抑制率的比较 见表1。与对照组比较，MPP+组SOD、GSH抑制率显著降低(均P<0.05)。与MPP+组比较，FUC预保护组及SEL预保护组SOD、GSH抑制率显著升高(均P<0.01)。FUC预保护组与SEL预保护组SOD、GSH抑制率比较差异无统计学意义(均P>0.05)。

表1 各组间MN9D细胞内SOD、GSH抑制率的比较(%)组别SODGSHMPP+组5．45±1．53∗1．54±0．38∗FUC预保护组16．01±2．14△2．86±0．72△SEL预保护组15．23±2．88△2．78±0．77△对照组19．86±4．414．84±0．99 注：与对照组比较∗P<005；与MPP+组比较△P<001

2.3 各组细胞形态的比较 见图1。对照组细胞形态正常，数目均匀；MPP+组细胞形态变圆，胞体变小，突起变短或消失，细胞数目减少；FUC预保护组细胞数目略多，形态完整，胞体突起变短，数量较MPP+组明显增加； SEL预保护组细胞形态好转，突起变短，细胞形态明显好转，数目较MPP+组增多。

图1 各组MN9D细胞形态 A：对照组细胞形态正常，细胞数目均匀；B：MPP+组细胞形态变圆，胞体变小，突起变短或消失，细胞数目减少；C：FUC预保护组细胞数目略多，细胞形态完整，胞体突起变短；D：SEL预保护组细胞形态好转，突起变短，细胞数目较MPP+组增多

2.4 各组间LC3-Ⅱ、CatD、Bax蛋白表达水平比较 见表2、图2。与对照组比较，MPP+组CatD蛋白、LC3-Ⅱ蛋白及Bax蛋白水平表达显著增加(均P<0.001)。与MPP+组比较，FUC预保护组、SEL预保护组及CatD抑制剂组CatD蛋白、LC3-Ⅱ蛋白及Bax蛋白水平显著下降(均P<0.001)。FUC组、SEL组及CatD抑制剂组CatD蛋白、LC3-Ⅱ蛋白及Bax蛋白水平差异无统计学意义(均P>0.05)。

表2 各组间MN9D细胞相关蛋白表达的比较(x±s，OD值)组别LC3⁃Ⅱ蛋白CatD蛋白Bax蛋白MPP+组0．462±0．01∗0．403±0．01∗0．399±0．02∗FUC预保护组0．308±0．02△0．280±0．01△0．263±0．02△SEL预保护组0．316±0．01△0．254±0．02△0．262±0．01△CatD抑制剂组0．311±0．07△0．250±0．01△0．260±0．01△对照组0．239±0．020．219±0．020．215±0．01 注：与对照组比较∗P<0001；与MPP+组比较△P<0001

图2 各组间LC3-Ⅱ、CatD、Bax蛋白表达

3 讨 论

PD是神经系统慢性变性病[7]，主要病理改变是中脑黑质部位多巴胺能神经元变性坏死，导致纹状体内多巴胺含量减少，出现锥体外系症状。目前研究[8]认为，PD是年龄老化、环境因素及遗传因素相互作用的结果。其中氧化应激、线粒体及溶酶体途径及细胞凋亡在PD发病机制中的重要作用[9]，寻求神经保护药物是PD的研究热点[10]。

氧化应激是受到关注最多的一种PD发病机制[11]。尸检[12]结果表明，PD患者黑质部位存在严重的氧化应激，如游离铁离子增多、GSH含量下降、线粒体复合体Ⅰ功能受损以及大量被氧化损伤的脂质、蛋白质和DNA等；1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)或6-羟多巴胺(6-OHDA)等神经毒素也可在体内产生自由基，破坏纹状体多巴胺能神经元。这些都提示氧化应激可能与PD的发生和进展密切相关。自噬是溶酶体依赖的蛋白质降解途径[13]，可导致蛋白质聚集体甚至整个细胞器的降解，与PD 的发生发展有密切相关[14-15]。研究[16]表明，自噬可能是凋亡的一个触发因素。LC3-Ⅱ是目前公认的自噬体标记物，其表达增高表明细胞自噬增加进而导致细胞凋亡。近年来研究[17]发现，自噬可能是PD发病的原因。MPP+可致细胞线粒体功能障碍、氧化应激等最终导致细胞死亡，常用来制备PD细胞模型[18]。近年来有研究[19]认为，MPP+通过溶酶体途径导致细胞线粒体损伤及自由基清除障碍，溶酶体释放CatD，进而导致细胞凋亡。本研究结果显示，与对照组比较，MPP+组LC3-Ⅱ蛋白水平显著增加(P<0.001)。与MPP+组比较，FUC预保护组、SEL预保护组及CatD抑制剂组CatD蛋白、LC3-Ⅱ蛋白及Bax蛋白水平显著下降(均P<0.001)。本研究采用司雷吉兰(SEL)作为阳性药物对照组，SEL为单胺氧化酶B抑制剂，是临床有效的PD治疗药物，证实了本研究的稳定性。CatD抑制剂——PepstatinA可以特异性阻断CatD蛋白表达，抑制Bax的表达，减少细胞凋亡。而本研究结果提示，FUC可能具有类似CatD抑制剂的作用，降低MPP+导致的MN9D细胞溶酶体损伤。

多糖是生物体内重要的生物大分子，是动植物中的支持组织和重要的能量来源。研究[6]发现，GAG具有在细胞内溶酶体和线粒体水平上对氧化应激诱导细胞凋亡发生早期负调控的作用。FUC与GAG结构成分非常类似。既往研究[20]表明，FUC有抗氧化及抗凝作用，对AD细胞模型具有抗氧化神经保护作用。本研究组前期研究[21-22]发现，FUC通过抗炎作用影响细胞信号转导通路，对PD细胞模型有保护作用。本研究观察了FUC对MPP+诱导的MN9D细胞模型抗氧化指标及溶酶体相关蛋白影响发现，与对照组比较，MPP+组SOD、GSH抑制率显著降低(均P<0.05)。与MPP+组比较，FUC预保护组及SEL预保护组SOD、GSH抑制率显著升高(均P<0.01)。与对照组比较，MPP+组LC3-Ⅱ蛋白及Bax蛋白水平表达显著增加(均P<0.001)。与MPP+组比较，FUC预保护组、SEL预保护组及CatD抑制剂组LC3-Ⅱ蛋白及Bax蛋白水平显著下降(均P<0.001)。提示FUC可能具有CatD抑制作用，可能通过保护溶酶体-线粒体通路，抑制了细胞凋亡途径，抗细胞内氧化应激，对PD细胞模型有保护作用。

本研究证实，FUC能减少PD细胞模型内溶酶体相关LC3-Ⅱ蛋白及CatD蛋白表达，抑制凋亡蛋白Bax，增加细胞内SOD、GSH，对抗氧化应激损伤，保护MN9D细胞。提示溶酶体相关CatD-Bax及氧化应激可能是FUC保护PD细胞模型的作用机制及靶点，需进一步研究。

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Effect of fucoidan on introcelleral oxidative stress and Cathepsin D-Apoptosis associated protein Bax of the 1-methyl-4-phenylpyridinium intoxicated MN9D cell model

LIANGZhi-gang,SUNXu-wen,LIMin,etal.

DepartmentofNeurology,YuhuangdingHospital,Yantai264000,China

Objective To explore the effect of fucoidan(FUC) introcelleral oxidative stress and Cathepsin D-Apoptosis(CatD) associated protein Bax of the 1-methyl-4-phenylpyridinium(MPP+) intoxicated MN9D cell model. Methods PD cell model was established by MN9D cells model which damaged by 100 mol/L MPP+. The cell viability of PD cell model was observed after FUC pretreatment. The inhibitory rate of superoxide dismutase(SOD) and glutathione reductase (GSH) were measured by fluorescence detection. The expression of Bax, CatD and microtubule-associated protein light chain3(LC3-Ⅱ) were measured by western blot.Results Compared with MPP+group, the cell viability were significantly increased than those after 1×10-6, 10-5, 10-4mol/L FUC pretreatment(allP<0.01). Compared with control group, the inhibitory rate of SOD and GSH in MPP+group were significantly decreased(allP<0.05). Compared with MPP+group, the inhibitory rate of SOD and GSH in FUC pretreatment group and SEL pretreatment group were significantly higher(allP<0.01). There was no significant difference in inhibitory rate of SOD and GSH between FUC pretreatment group and SEL pretreatment group. The expression of CatD, LC3-Ⅱ and Bax protein in MPP+group were significantly increased than those in control group(allP<0.001). The expression of CatD, LC3-Ⅱ and Bax protein in FUC pretreatment group, SEL pretreatment group and CatD inhibitor group were significantly decreased than those in MPP+group(allP<0.001). There was no significant difference of expression of CatD, LC3-Ⅱand Bax protein between FUC pretreatment group, SEL pretreatment group and CatD inhibitor group. Conclusions FUC has protective effect on PD cell model. The mechanism are protecting cell lysosomes, inhibiting expression of CatD-Bax, reducing oxidative stress and inhibiting apoptosis.

fucoidan;MN9D cells;1-methyl-4-phenylpyridinium;oxidation stress;apoptosis

烟台市科技发展项目资助(2012077)

264000青岛大学附属烟台毓璜顶医院神经内科(梁志刚，孙旭文，李敏，窦连伟，陶曼丽)；首都医科大学脑重大疾病研究院(王晓民)

R539

A

1004-1648(2017)04-0285-05

2016-04-13

2016-08-13)