利拉鲁肽对高糖诱导大鼠近端小管上皮细胞Toll 样受体4表达和钠钾ATP酶活性影响*

王兴红，郑亚萍，王丽菲

(1.漯河医学高等专科学校生理教研室，漯河 462000；2.昆明医科大学第三附属医院、云南省肿瘤医院头颈外科，昆明 650000)

利拉鲁肽对高糖诱导大鼠近端小管上皮细胞Toll 样受体4表达和钠钾ATP酶活性影响*

王兴红1，郑亚萍1，王丽菲2

(1.漯河医学高等专科学校生理教研室，漯河 462000；2.昆明医科大学第三附属医院、云南省肿瘤医院头颈外科，昆明 650000)

目的 探讨利拉鲁肽(Li)对高糖诱导大鼠近端小管上皮细胞(PTEC)的保护作用。方法 体外原代培养大鼠PTEC。将细胞分为正常对照组、模型对照组、Li小剂量组、Li中剂量组、Li大剂量组，每组设6个复孔，作用72 h后液闪法测定PTEC钠钾ATP酶活性；Western blot测定Toll 样受体4(TLR4)蛋白表达；酶联免疫吸附(ELISA)法测定细胞培养上清白细胞介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)的含量。结果 与正常对照组比较，高糖培养72 h PTEC钠钾ATP酶活性[(2 737.88±317.22) μmol·g-1·h-1]升高，细胞和培养液中TLR4蛋白表达、IL-6、 TNF-α和PAI-1增加，均差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)；与模型对照组比较，Li中、大剂量组作用72 h 后PTEC钠钾ATP酶活性[(2 487.76±215.54)，(2 301.55±207.63) μmol·g-1·h-1]明显降低，细胞和培养液中TLR4蛋白表达、IL-6、TNF-α和PAI-1降低，均差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。结论 Li在一定程度上抑制高糖环境炎症细胞因子表达并能稳定钠钾ATP酶活性，可能对肾脏有一定的保护作用。

利拉鲁肽；近端小管上皮细胞；钠钾ATP酶；炎症；Toll 样受体4

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)发病机制尚无定论，近年来炎症学说备受关注。Toll样受体家族(Toll-like receptors，TLRs)是介导慢性炎症反应的关键因素，其中Toll样受体4(Toll-like receptor 4，TLR4)过表达是导致糖尿病肾损伤的重要机制之一[1]。利拉鲁肽(liraglutide，Li) 已成为治疗2型糖尿病的研究热点，其是否具有肾脏保护作用至今尚未阐明。本研究拟在细胞水平观察Li对高糖诱导大鼠近端小管上皮细胞(proximal tubule epithelial cells，PTEC)TLR4等炎症因子和钠钾ATP酶活性的影响，为临床应用Li防治DN提供实验和理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物 健康Wistar 大鼠，清洁级，体质量(250±20) g，由河南省实验动物中心提供(动物使用合格证号：410217，动物生产许可证号：SYXK(豫)2010-0011)，动物实验室温度22～25 ℃，相对湿度：55%～70%，黑暗和光照时间比为12 h：12 h。全部大鼠常规饲料喂养，自由饮水。

1.2 药物与试剂 Li注射溶液(丹麦诺和诺德公司生产，规格：3 mL：18 mg，每盒1支，批号：20120224)；RPMI1640培养液(美国Gibco 公司，批号：20121201)；Ⅱ型胶原酶(美国Gibco 公司，批号：20120911)；胎牛血清(杭州四季青生物工程有限公司，批号：20130111)；考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒(南京建成生物工程公司，批号：20130321)；D-(+)-葡萄糖(美国Sigma公司，批号：20111223，含量：≥99.5%)；链霉亲和素-生物素复合物(strept avidin-biotin complex，SABC)、Mouse IgG试剂盒(批号：20130211)及二氨基联苯胺显色试剂盒(批号：20130211)均购自武汉博士德公司；[γ-32P]ATP(北京福瑞生物工程公司核酸研究室，批号：20130221)；白细胞介素-6 (interleukin-6，IL-6)酶联免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒(批号：20120129)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)ELISA试剂盒(批号：20120219)、纤溶酶原激活物抑制剂-1(plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1)ELISA试剂盒(批号：20120329)均购自南京建成生物工程研究所；TLR4小鼠抗大鼠单克隆抗体(美国Santa Cruz公司，批号：20120512)；β-actin(北京博奥森生物公司，批号：20111223)。

1.3 主要仪器 紫外分光光度计(日本岛津公司)；全自动酶联免疫吸附仪(芬兰Thermo Labsytom公司)，Power-pac200电泳仪(美国BIO-RAD公司)，Trans-Blot电泳湿转仪(美国BIO-RAD公司)，液体闪烁计数器(上海核所日环光电仪器有限公司)。

1.4 原代PTEC的培养与鉴定 按照杜飞等[2]改良的Doucet手工微分离法分离大鼠单根近端小管，原代培养大鼠PTEC。将近端肾小管置入2 mL RPMI1640培养液的培养瓶中，置37 ℃、含5%二氧化碳(CO2)的培养箱中原代培养，于第3天更换第一次培养液，7～8 d细胞基本铺满瓶底。行免疫细胞化学SABC法鉴定细胞。

1.5 实验分组 用MTT法检测高糖和Li对细胞增殖的影响，由此选出高糖及药物浓度。PTEC生长至基本铺满瓶底，将其消化并接种于96孔板，24 h后更换为无血清RPMI1640低糖培养液培养24 h使细胞同步化，然后将细胞随机分为5组。正常对照组：PTEC培养于含5.6 mmol·L-1葡萄糖普通无血清RPMI1640培养液中；模型对照组：PTEC培养于含25 mmol·L-1葡萄糖普通无血清RPMI1640培养液中；Li小剂量组：PTEC培养于含25 mmol·L-1葡萄糖普通无血清RPMI1640培养液同时给予Li 10 nmol· L-1干预；Li中剂量组：PTEC培养于含25 mmol·L-1葡萄糖普通无血清RPMI1640培养液同时给予100 nmol· L-1Li干预；Li大剂量组：PTEC培养于含25 mmol·L-1葡萄糖普通无血清RPMI1640培养液同时给予Li1 000 nmol· L-1干预。每组设6个复孔，作用72 h后取样观察。

1.6 原代PTEC钠钾ATP酶活性的测定 将各组处理后的PTEC消化并移至离心管中，用4 ℃磷酸盐缓冲液(phosphate buffered solution,PBS)冲洗2次，1 000 r·min-1(r=250 mm)离心10 min后弃上清液，加入三蒸水100 μL，然后-80 ℃与37 ℃水浴两次快速低渗并冻融处理，再置4 ℃ 冰箱。钠钾ATP酶活性(μmol·g-1·h-1)=(X-B)/蛋白浓度×样本体积×孵育时间(h)×[γ-32P]ATP比活性。X为待测样本的液体闪烁计数值，B为空白对照管的液体闪烁计数值[2-3]。

1.7 细胞培养液上清液IL-6和TNF-α及PAI-1的检测 取培养液中的上清液，通过自动酶免分析仪测定IL-6、TNF-α、PAI-1水平，在波长550 nm光下读取吸光度(A)值，应用标准曲线计算含量。操作严格按照相应的ELISA试剂盒说明书进行。

1.8 Western blot测定TLR4蛋白表达 按照不同的实验要求，收集各组PTEC，用苯甲基磺酰氟摄取蛋白质，测定总蛋白含量。蛋白样品行10%聚丙烯酰胺凝胶电泳，转移至聚偏二氟乙烯膜上，封闭，加入一抗[TLR4小鼠抗大鼠单克隆抗体(1：1 000)]，4 ℃过夜，倾去一抗，TBST洗膜3次，每次15 min。洗涤后二抗孵育[羊抗小鼠抗体(1：5 000)]，置摇床上摇动，室温下1 h，弃去二抗，Tris-HCl缓冲液加吐温洗膜3次，每次15 min；电化学发光剂暗室曝光成像、摄相，IMAGE J软件分析求得积分A值。

2 结果

2.1 PTEC钠钾ATP酶的活性 与模型对照组比，经Li 100，1 000 nmol· L-1培养72 h 后，PTEC钠钾ATP酶活性显著降低(P<0.05，P<0.01)，而小剂量的Li(10 nmol· L-1)对高糖诱导的PTEC钠钾ATP酶活性无明显作用，见表1。

2.2 PTEC炎症因子IL-6和TNF-α及PAI-1的含量 与模型对照组比较，经Li 100，1 000 nmol· L-1培养72 h后，PTEC炎症因子IL-6、TNF-α、PAI-1水平显著降低(P<0.05或P<0.01)，而小剂量的Li(10 nmol· L-1)对高糖诱导的PTEC炎症因子IL-6、TNF-α、PAI-1水平无明显作用。见表1。

2.3 PTEC TLR4蛋白的表达 与模型对照组比较，经Li 100，1 000 nmol· L-1培养72 h 后，PTEC的TLR4蛋白表达显著降低(P<0.05或P<0.01)，而小剂量的Li(10 nmol· L-1)对高糖诱导的PTEC的TLR4蛋白表达无明显作用。见图1。

3 讨论

DN是糖尿病最为严重的并发症之一。近年来免疫炎症学说认为糖尿病是一种天然免疫激活和慢性低度炎症反应为特征的疾病。TLR能促进细胞因子的合成与释放，引发炎症反应。其中TLR4可以介导多种炎症及急性期反应的细胞因子形成，有研究证实其在DN发生、发展中起重要作用。DN早期存在明显的巨噬细胞浸润[4-5]。NF-κB是炎症调控的中心环节[6-7]。研究表明，单核巨噬细胞可以通过膜表面TLR感受PAMP刺激，经细胞内信号转导，最终由进入胞核内活化的NF-κB启动核内相关基因，合成IL-1、IL-6、IFN-γ、TNF-α等多种促炎因子并释放到细胞外，并形成复杂的细胞因子网络，介导免疫调节和炎症反应[8]。高糖培养细胞是目前体外复制糖尿病模型的一种重要手段[9]。本研究结果显示高糖环境下PTEC TLR4蛋白表达增高，培养液上清炎症因子IL-6、TNF-α、PAI-1含量增高，提示PTEC在高糖环境下出现炎症反应，其机制可能与TLR4/NF-κB 信号通路有关。Li是一种新型的GLP-1类似物，具有降低血糖，保护胰岛β细胞和心脏等多种作用[10]。本研究表明，Li可以抑制高糖环境下PTEC TLR4蛋白表达，从而减少培养液上清炎症因子IL-6、TNF-α、PAI-1含量。提示Li可能与抑制TLR4/NF-κB 信号通路有关，其可能通过阻断TLR信号通路介导的多种炎性细胞因子形成，抑制DN的发展。

表1 5组PTEC炎症因子IL-6和TNF-α及PAI-1的含量和钠钾ATP酶活性的比较

与正常对照组比较，*1P<0.01，*2P<0.05；与模型对照组比较，*3P<0.01，*4P<0.05

Compared with normal control group，*1P<0.01，*2P<0.05；compared with model control group，*3P<0.01，*4P<0.05

A.正常对照组；B.模型对照组；C.Li小剂量组；D.Li中剂量组；E.Li大剂量组；与正常对照组比较，*1P<0.01；与模型对照组比较，*2P<0.01，*3P<0.05

图1 5组大鼠PTEC Western blot测定TLR4蛋白的表达电泳图(Ⅰ)和柱形图(Ⅱ)

A.normal control group；B.model control group；C.low-dose Li group；D.medium-dose Li group；E.high-dose Li group；compared with normal control group，*1P<0.01；compared with model control group，*2P<0.01，*3P<0.05

Fig.1 Electrophotogram (Ⅰ) and Histogram (Ⅱ) of western blot analysis on TLR expression in PTEC of five groups of rats

PTEC是肾小管重吸收和分泌多种物质的重要细胞。有研究认为PTEC中钠与葡萄糖的转运过强，使钠盐在此段过度重吸收是DN发病的关键[11]。钠钾ATP酶是存在于PTEC细胞基底膜上的重要离子泵，它与多种重要物质的转运过程密切相关。研究钠钾ATP酶活性对深入了解肾脏功能异常具有重要意义。用链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠早期，其近端小管的钠钾ATP酶活性及其亚单位的表达均显著升高，与DN的发生、发展有显著的相关性[12]。本研究结果显示，高糖环境培养PTEC钠钾ATP酶活性显著升高，提示钠钾ATP酶参与肾基底膜损伤过程，而Li可以抑制高糖诱导的PTEC钠钾ATP酶活性的显著升高，并且呈现剂量依赖性，随着剂量的增加，稳定钠钾ATP酶活性的作用增强，达到保护肾小管上皮细胞作用。综上研究提示Li治疗DN的机制可能与其降低血糖，纠正机体及细胞代谢异常有关。具体途径还有待进一步研究。

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DOI 10.3870/yydb.2015.08.003

Effect of Liraglutide on Toll-like Receptor 4 and Na+/K+-ATPase Activity in Proximal Tubular Epithelial Cells of Rats Induced by High Glucose

WANG Xinghong1, ZHENG Yaping1, WANG Lifei2

(1.DepartmentofPhysiology,LuoheMedicalCollegeLuohe462000,China； 2.DepartmentofOtolaryngology-head&NeckSurgery,YunnanTumorHospital,theThirdAffiliatedHospitalofKunmingMedialUniversity,Kunming650000,China)

Objective To explore the protective effect of liraglutide (Li) on the proximal tubular epithelial cells (PTECs) of rats induced by high glucose. Methods The PTECs of rats were obtained by primary culture and divided into normal control group (NC), model control group (HG), HG+low-dose Li group, HG+ medium-dose Li group, and HG+high-dose Li group (n=6 in each group).After 72 h of incubation, the activity of Na+/K+-ATPase in PTECs was measured by the liquid scintillation counter.Protein expression of Toll-like receptor 4 (TLR4) was measured by Western blotting.Interleukin-6 (IL-6), tumor necrosis factor-α (TNF-α) and plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1) in culture supernatants were measured by the enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). Results Compared with NC, activity of Na+/K+-ATPase [(2 737.88±317.22) μmol·g-1·h-1] and the protein expression of TLR4 in PTECs, IL-6, TNF-α and PAI-1 in culture supernatants were significantly increased in HG (P<0.05, orP<0.01).Compared with HG, activity of Na+/ K+-ATPase and the protein expression of TLR4 in cells, IL-6, TNF-α and PAI-1 in culture supernatants reduced significantly in HG+ medium- or high dose Li groups (P<0.05, orP<0.01). Conclusion Liraglutide can inhibit the expression of inflammatory cytokines and stabilize the Na+/ K+-ATPase’s activity in PTECs in high glucose environment.Therefore, it may play a role in kidney protection.

Liraglutide；Proximal tubule epithelial cells；Na+/ K+-ATPase；Inflammation； Toll-like receptor 4

2014-07-23

2014-10-10

*漯河医学高等专科学校自然科学研究资助项目(2013-S-LMC24)

王兴红(1981-)，女，山东临沂人，讲师，硕士，研究方向：糖尿病肾病的发病机制与防治。电话：(0)15839575585，E-mail：xinghong0124@163.com。

R977.15； R587.1

A

1004-0781(2015)08-0998-04