麦芽提取物对高泌乳素血症大鼠脑垂体泌乳素表达及乳腺组织形态学的影响

朱梦军，肖晖，王雄，吴金虎

(武汉市第三医院药学部，武汉 430060)

麦芽提取物对高泌乳素血症大鼠脑垂体泌乳素表达及乳腺组织形态学的影响

朱梦军，肖晖，王雄，吴金虎

(武汉市第三医院药学部，武汉 430060)

目的 观察麦芽提取物对高泌乳素血症大鼠垂体泌乳素(PRL)表达及乳腺组织形态学的影响。方法 大鼠背部皮下注射盐酸甲氧氯普胺制备高泌乳素血症模型。60只大鼠分为正常对照组、模型对照组、溴隐亭组及麦芽提取物大、中和小剂量组。除正常对照组外，其他组进行造模。溴隐亭组给予溴隐亭0.389 mg·kg-1·d-1；麦芽提取物小、中和大剂量组分别给予麦芽提取物7.98，15.96和31.92 g·kg-1·d-1；正常对照组和模型对照组给予等容量纯化水。大鼠在造模成功后，灌胃给予相应的药物进行治疗给药，每次2 mL，每日1次，连续30 d。对大鼠脑垂体PRL阳性细胞进行计数，采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测大鼠垂体PRL mRNA的表达水平，以及采用免疫组化法观察乳腺组织形态学的变化。结果 正常对照组，模型对照组，溴隐亭组，麦芽提取物大、中和小剂量组的PRL阳性细胞数量分别为(2.4±0.3)，(21.7±0.8)，(3.8±0.5)，(4.5±0.4)，(6.7±0.5)，(15.8±1.2)个，PRL mRNA表达水平分别为(0.31±0.02)，(1.58±0.06)，(0.45±0.04)，(0.49±0.03)，(0.61±0.04)，(0.95±0.09)。与正常对照组比较，模型对照组大鼠脑垂体PRL阳性细胞数量和PRL mRNA表达水平显著增加(P<0.01)，同时乳腺组织出现增生。与模型对照组比较，麦芽提取物大、中剂量组大鼠脑垂体PRL阳性细胞数量和PRL mRNA表达水平显著减少(P<0.01)，而且乳腺增生明显减轻。结论 麦芽提取物能有效治疗高泌乳素血症及抑制乳腺组织的增生，作用机制是其显著降低高泌乳素血症大鼠脑垂体PRL的表达。

麦芽提取物；高泌乳素血症；垂体；泌乳素；乳腺组织

高泌乳素血症(hyperprolactinemia，HPRL)是由病理性、药理性、生理及特发性因素引起泌乳素浓度增高(>25 ng·mL-1)的一种下丘脑-垂体疾病，临床上以闭经、月经稀少、不孕及溢乳等症状常见[1]。在普通人群中HPRL的发生率为0.4%，而在生殖障碍的女性发病率为9%～17%，是严重危害女性健康的一种疾病[2]。目前治疗HPRL药物存在价格昂贵、不良反应大等特点，患者依从性很差，很难坚持治疗[3-4]。我国《医学衷中参西录》《中华本草》等许多古医籍和现代中药学权威工具书均记载和认同麦芽的回乳功效[5-6]。据文献报道，麦芽提取物能显著降低高泌乳素血症大鼠血清催乳素(prolactin，PRL)的水平[7-9]，但是其发挥作用的具体机制尚不清楚。本研究在此基础上，观察麦芽提取物对高泌乳素血症大鼠脑垂体PRL表达水平及乳腺组织形态学的影响，进一步揭示其抗高泌乳素血症的药效作用及机制，为其深入研究开发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 动物 无特定病原体(specefic pathogen free，SPF)级雌性未孕斯泼累格·多雷(Sprague Dawley,SD)大鼠60只，体质量200～250 g，购于华中科技大学实验动物中心，合格证号：No.42009800000584，动物生产许可证号：SCXK(鄂)2010-0009。实验前动物置于室内适应环境1周，室温18～25 ℃，相对湿度55%～70%，黑暗和光照时间比12 h：12 h。

1.2 药物及试剂 麦芽购自湖北清大药业有限公司，产地安徽亳州，经湖北中医药大学药学院陈科力教授鉴定为麦芽正品[禾本科植物大麦(HordeumVulgare.L)的成熟果实经发芽干燥而得]，符合《中华人民共和国药典》相关项下的规定。甲磺酸溴隐亭：Novartis Pharma Schweiz AG生产，批号：10080。盐酸甲氧氯普胺注射液(灭吐灵)：河南润弘制药股份有限公司，批号1308612。Trizol、RNA 酶抑制剂(上海丽臣生物科技有限公司，批号：0629546)，大鼠泌乳素基因引物和内标引物由北京奥科生物技术有限责任公司设计，M-MLV 逆转录酶、PCR-Mix(武汉博士德生物科技有限公司，批号：55248812)，抗大鼠 PRL 抗体、ENVISION 试剂(美国 DAKO 公司，批号：13214679)，PRL酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immuno-sorbent assay，ELISA)检测试剂盒(深圳欣博盛生物科技有限公司，批号：201305443)。

1.3 麦芽提取物的制备 干燥麦芽药材1 kg粉碎后，经10倍量水煎煮，每次1.5 h，共2次，滤液经减压浓缩得到麦芽提取物408 g，产率为40.8%，于4 ℃冰箱下保存备用。麦芽提取物以大麦芽碱为其质量控制指标，其大麦芽碱含量不低于0.035%。

1.4 HPRL模型制备与分组给药 在大鼠背部皮下注射盐酸甲氧氯普胺注射液，剂量为50 mg·kg-1，每天9：00和16：00分别注射1次，连续5 d[10]。ELISA试剂盒检测大鼠血清中PRL的含量，与正常大鼠比较，造模大鼠血清PRL含量显著升高，证实HPRL模型制备成功。50只造模成功的大鼠按照随机数字表法随机分为5组，每组10只，分别为模型对照组，溴隐亭组，麦芽提取物大、中和小剂量组，以10只正常大鼠作对照。动物灌胃药物剂量参照人服药的剂量，采用体表面积法进行换算而来。溴隐亭组给予溴隐亭0.389 mg·kg-1·d-1；麦芽提取物小、中和大剂量组分别给予麦芽提取物7.98，15.96和31.92 g·kg-1·d-1；正常对照组和模型对照组给予等容量纯化水。除正常对照组外，其他组进行造模。大鼠在造模成功后，灌胃给予相应的药物进行治疗，每次2 mL，每日1次，连续30 d。

1.5 大鼠脑垂体PRL阳性细胞的计数 给药30 d后，处死大鼠。摘除大鼠脑垂体，进行常规石蜡包埋，应用免疫组化法检测大鼠脑垂体组织中 PRL 的水平。石蜡切片脱蜡后，加 3%过氧化氢(H2O2)室温孵育 5 min，滴加大鼠来源的 PRL抗体(一抗)，室温60 min，磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution，PBS)冲洗3 次，每次2 min，然后滴加 Envision试剂(含二抗、三抗)，室温下孵育60 min，PBS冲洗3 次，每次2 min，应用 DAB 溶液显色，纯化水冲洗、复染、脱水、封片。显微镜(×200 倍)下，对PRL 阳性细胞进行计数。

1.6 大鼠脑垂体组织中PRL mRNA表达水平的分析 用Trizol抽提大鼠脑垂体组织总RNA，加入三氯甲烷0.25 mL，4 ℃，以12 000 r·min-1的转速离心5 min，加入等体积异丙醇，混匀后静置，离心弃上清液，用75%乙醇1 mL洗沉淀，离心弃上清液，室温干燥。将 RNA 样品及引物于PCR仪中，进行模板 cDNA 的合成(RT反应)，RT 产物于-20 ℃冰箱保存。对目的基因进行扩增后，将PCR扩增产物加样于1.5%琼脂糖凝胶，在70 V 恒压电泳20 min，于UVP 计算机图像分析系统测定样本灰度值，以β-actin 作为内参照，计算相对含量。

1.7 大鼠乳腺组织形态学检查 乳腺组织经苏木精-伊红(hematoxylin and eosin，HE)染色后，显微镜下进行观察，包括小叶、腺泡增生情况，导管形状及厚度，以及是否出现分泌物。

2 结果

2.1 大鼠脑垂体PRL阳性细胞数量分析 在200倍视野下，随机计5个小格的PRL阳性细胞数，取平均值。与正常对照组比较，模型对照组大鼠脑垂体PRL阳性细胞平均计数显著升高(F=20.146，P<0.01)；与模型对照组比较，溴隐亭组(F=16.227，P<0.01)、麦芽提取物大剂量组(F=14.131，P<0.01)和中剂量组(F=11.552，P<0.01)的PRL阳性细胞平均计数明显减少。见表1。

表1 6组大鼠脑垂体PRL阳性细胞数量测定值

Tab.1 Positive cell count of pituitary PRL in six groups of rats

±s

与正常对照组比较，*1P<0.01；与模型对照组比较，*2P< 0.01

Compared with normal control group，*1P<0.01；compared with model control group，*2P< 0.01

2.2 RT-PCR检测大鼠脑垂体组织PRL mRNA表达水平 PRL在各组大鼠垂体组织中均有表达，其中模型对照组的表达水平明显高于正常对照组，溴隐亭组、麦芽提取物大和中剂量组的表达水平明显低于模型对照组，见图1。与正常对照组比较，模型对照组大鼠脑垂体组织PRL mRNA表达水平显著升高(F=14.536，P<0.01)；与模型对照组比较，溴隐亭组(F=12.473，P<0.01)，麦芽提取物大剂量组(F=10.662，P<0.01)和中剂量组(F=7.145，P<0.05)的PRL mRNA 表达水平明显降低，见表2。

2.3 对乳腺组织病理形态学的影响 显微镜下可见，正常对照组大鼠乳腺小叶、腺泡和导管无增生、扩张，腺体数量少，无分泌物；模型对照组大鼠乳腺小叶、腺泡和导管严重增生，存在大量分泌物；溴隐亭组大鼠乳腺小叶、腺泡部分增生，导管轻度扩张，可见分枝，腔内有少许分泌物；麦芽提取物小剂量组大鼠乳腺小叶、腺泡和导管严重增生，仍存在许多分泌物；麦芽提取物大、中剂量组大鼠乳腺腺泡分布均匀，基本恢复正常，大多数导管细长，无分支和分泌物，见图2。

3 讨论

PRL是由位于腺垂体后侧位的泌乳细胞所分泌的一种蛋白质类激素，由 199 个氨基酸残基构成的含3 个二硫键的单链蛋白，具有一个由4 个反向平行的α螺旋构成的结构[11]。各种因素引起腺垂体嗜酸性细胞分泌过多的PRL(>25 ng·mL-1)，则会引发一系列疾病，西医称为HPRL，其临床表现有溢乳、闭经、月经稀少、不孕等[12]。

M.Marker；A.正常对照组；B.模型对照组；C.溴隐亭组；D.麦芽提取物小剂量组；E.麦芽提取物中剂量组；F.麦芽提取物大剂量组.

图1 RT-PCR产物

M.Marker；A.normal control group；B.model control group；C.bromocriptine group；D.low-dose malt extract group；E：middle-dose malt extract group；F.high-dose malt extract group

Fig.1 RT-PCR products

表2 6组大鼠脑垂体组织PRL mRNA 表达水平

与正常对照组比较，*1P<0.01；与模型对照组比较，*2P<0.01，*3P<0.05

Compared with normal control group，*1P<0.01；compared with model control group，*2P<0.01，*3P<0.05

血清PRL浓度的增高会扰乱下丘脑-垂体-性腺轴的功能，使下丘脑促性腺激素释放激素(gonadotropin-releasing hormone，GnRH)合成和分泌受阻，并减弱垂体对GnRH的敏感性，导致促卵泡激素和黄体生成素分泌低下，进而卵巢分泌的雌二醇、孕酮不足，造成卵泡发育不良和黄体功能不足而致月经失调、闭经和不孕等。

A.正常对照组；B.模型对照组；C.溴隐亭组；D.麦芽提取物小剂量组；E.麦芽提取物中剂量组；F.麦芽提取物大剂量组

图2 6组大鼠乳腺组织形态学病理图片(HE，×200)

A.normal control group；B.model control group；C.bromocriptine group；D.high-dose malt extract group；E.middle-dose malt extract group；F.low-dose malt extract group

Fig.2 Histomorphology of mammery tissue in six groups of rats(HE，×200)

研究发现，PRL与正常乳腺上皮细胞的泌乳素受体结合，会产生一系列反应，包括刺激α乳清蛋白的合成、尿嘧啶核苷酸转换、乳腺细胞钠离子(Na+)的转换及脂肪酸的合成，刺激乳腺腺泡发育和促进乳汁的生成和分泌[13]。泌乳素异常升高可进一步刺激雌激素合成，或抑制孕激素的分泌和抑制促卵泡激素、黄体生成素分泌，从而使雌激素的相对含量及活性增高，导致雌二醇长期过度刺激乳腺组织，从而造成乳腺增生[14]。

文献报道，麦芽提取物能显著降低HPRL大鼠血清PRL的水平，但具体作用机制尚不清楚。本研究发现，麦芽提取物能显著抑制HPRL大鼠脑垂体PRL阳性细胞的数量和PRL mRNA的表达；同时，观察到HPRL大鼠乳腺组织增生较严重，而麦芽提取物能显著抑制其乳腺组织的增生。该研究从分子水平上证实了麦芽抗HPRL的确切疗效，并且揭示其发挥药效的作用机制是抑制脑垂体PRL mRNA的表达。不过，今后的研究还应深入探索麦芽中抗HPRL的活性成分及作用机制，为开发出具有自主知识产权的抗HPRL药物奠定基础。

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DOI 10.3870/yydb.2015.08.012

Effects of Malt Extract on Hypophysis Prolactin Expression and Morphology of Mammary Tissues in Hyperprolactinemia Rats

ZHU Mengjun, XIAO Hui, WANG Xiong, WU Jinhu

(DepartmentofPharmacy,theThirdHospitalofWuhanCity,Wuhan430060,China)

Objective To observe the effects of malt extract on prolactin expression and morphology of mammary tissue in hyperprolactinemia rats. Methods Metoclopramide hydrochloride was injected subcutaneously to establish hyperprolactinemia model.Sixty rats were divided into normal control group, model control group, bromocriptine group, high-dose, middle-dose and low-dose malt extract groups.Except normal control group, hyperprolactinemia model was established in the other groups.Bromocriptine (0.389 mg·kg-1·d-1) was given to bromocriptine group.Malt extract (7.98, 15.96 and 31.92 g·kg-1·d-1) was administered in low-dose, middle-dose and high-dose malt extract groups.Equal volume of purified water was given to normal control group and model control group.After 30 days of administration, PRL positive cell number of rat hypophysis was counted.RT-PCR was used to measure hypophysis PRL mRNA expression, and morphology of mammary tissues was observed by immunohistochemical method. Results PRL positive cell number was (2.4±0.3), (21.7±0.8), (3.8±0.5), (4.5±0.4), (6.7±0.5) and (15.8±1.2) in normal control group, model control group, bromocriptine group, high-dose, middle-dose and low-dose malt extract groups.PRL mRNA expression level was (0.31±0.02), (1.58±0.06), (0.45±0.04), (0.49±0.03), (0.61±0.04), and (0.95±0.09), respectively.As compared with normal control group, hypophysis PRL positive cell number and PRL mRNA expression level of high-dose and middle-dose malt extract group were increased significantly (P<0.01), and hyperplasia of mammary glands appeared.As compared with model control group, hypophysis PRL positive cell number and PRL mRNA expression level of high-dose and middle-dose malt extract group was decreased significantly (P<0.01), and hyperplasia of mammary glands was alleviated obviously. Conclusion Malt extract can effectively treat hyperprolactinemia and inhibit hyperplasia of mammary glands through significantly decreasing the expression of hypophysis prolactin in hyperprolactinemia rats.

Malt extract； Hyperprolactinemia； Hypophysis； Prolactin； Mammary tissue

2014-04-17

2014-07-21

朱梦军(1965-)，男，湖北武汉人，药师，学士，研究方向：医院药学。电话：(0)15971479069，E-mail：zhumengjun133494@163.com。

吴金虎(1962-)，男，湖北十堰人，主任药师，博士，研究方向：中药物质基础研究。电话：027-68894991，E-mail：546939322@qq.com。

R285.5

A

1004-0781(2015)08-1036-04