罗格列酮对百草枯致大鼠肺损伤的炎症抑制作用*

刘振宁，高嵩岚，张红雷，赵敏

(中国医科大学附属盛京医院急诊科，沈阳 110004)

·药物研究·

罗格列酮对百草枯致大鼠肺损伤的炎症抑制作用*

刘振宁，高嵩岚，张红雷，赵敏

(中国医科大学附属盛京医院急诊科，沈阳 110004)

目的 研究罗格列酮对百草枯致大鼠肺损伤过程中的炎症抑制作用机制。方法 将72只SD雄性大鼠随机分成3组，每组24只。模型对照组：腹腔注射百草枯20 mg·kg-1；罗格列酮组：腹腔注射百草枯前1 h，腹腔注射罗格列酮10 mg·kg-1；空白对照组：腹腔注射0.9%氯化钠溶液1 mL。注射百草枯后4，8 h及1，3 d，收集各组大鼠血清和肺组织标本，组织切片苏木精-伊红(HE)染色进行肺损伤评分，采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清白细胞介素-1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量，采用免疫组化方法检测NF-κB蛋白在肺组织的表达，利用Western blot法检测肺组织核因子-κB (NF-κB)和激活蛋白(AP-1)蛋白表达水平。结果 模型对照组大鼠血清炎性细胞因子IL-1β和TNF-α含量明显增加。罗格列酮组肺组织损伤程度明显降低，血清IL-1β和TNF-α含量减少，肺组织NF-κB和AP-1 蛋白的表达降低。结论 罗格列酮可以抑制百草枯中毒大鼠肺组织NF-κB和AP-1 蛋白表达，减少IL-1β和TNF-α分泌，对百草枯所致大鼠肺损伤炎症有抑制作用。

罗格列酮；百草枯；损伤，肺；核因子-κB；激活蛋白-1；炎症

百草枯(paraquat，PQ)属于有机杂环类触杀型除草药，是目前我国以及亚太其他地区广泛使用的除草药之一。自杀性口服或误服PQ中毒病例屡见不鲜，由于目前临床缺乏有效解毒药，导致该病死亡率较高[1]。PQ通过肺多胺摄取系统并蓄积于肺组织，定位于Ⅰ、Ⅱ型肺泡细胞及细支气管细胞，产生氧化应激以及炎症反应，导致急性肺损伤。临床急性期可以表现为急性呼吸窘迫综合征，慢性期可以表现为肺纤维化。罗格列酮是过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(peroxisome proliferator activated receptors，PPAR-γ) 的激动药，可以激活PPAR-γ产生抗氧化作用和抗炎作用[2-3]。核因子-κB (nuclear factor - kappa B，NF-κB)[4]和转录因子激活蛋白-1(activating protein-1，AP-1)[5]都是炎症反应的关键调控因子，参与许多炎症性疾病发生、发展过程。笔者在本研究中采用罗格列酮对PQ中毒大鼠进行预处理，检测NF-κB和AP-1以及炎性细胞因子表达，研究分析罗格列酮对百草枯导致肺损伤的炎症抑制作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物 清洁级雄性斯泼累格·多雷(Sprague Dawley,SD)大鼠，体质量200～250 g，由中国医科大学实验动物中心提供。生产许可证号：SCXK(辽)2003-0009，使用许可证号： SYXK(辽)2003-0013。大鼠适应性喂养1周，大鼠饲养的温度控制20～25 ℃、湿度控制40%～70%，昼夜节律控制12 h，自由进食水。

1.2 药品与试剂 PQ(50 mg，批号：36541 )、罗格列酮(10 mg，批号：R2408 )购自美国Sigma-Aldrich公司，样品纯度均为分析纯；白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)Elisa试剂盒(批号：E09479-1641，E09323-1639)购自美国eBioscience公司；NF-κB p65抗体(批号：ab23218)购自美国Abcam公司；c-Fos和c-Jun抗体(批号： sc-52，sc-44)购自美国Santa Cruz公司；SABC免疫组化试剂盒(批号：SA1055)和DAB显色试剂(批号：AR1022)购自武汉博士德生物有限公司。

1.3 仪器与设备 石蜡切片机和石蜡包埋机(Leitz，德国)；电泳仪、半干转印仪(BIO-RAD，美国)；冷冻离心机(Thermo Scientific Heraeus Multifuge X1，美国)；显微摄像系统(Q cupture prol Evolution ncp 5.01 BX51，日本)。

1.4 动物分组与给药 将72只SD大鼠随机平均分成3组，每组24只。模型对照组：腹腔注射PQ20 mg·kg-1；罗格列酮组在腹腔注射PQ前1 h腹腔注射罗格列酮10 mg·kg-1；空白对照组：0.9%氯化钠溶液1 mL，腹腔注射。

1.5 标本的采集及保存 在PQ腹腔注射后4，8 h及1，3 d时，每组在每个时间点取出6只大鼠，充分麻醉后常规消毒，打开胸腔，使用5 mL注射器刺入右心室，缓慢取血。将血置入10 mL离心管中，3 000 r·min-1(r=9.64 cm)、4 ℃，离心10 min，取上清液置-80 ℃冰箱保存。完整取出两侧肺组织，使用0.9%氯化钠溶液冲洗肺组织，将肺叶液氮速冻后置于-80 ℃冰箱保存。

1.6 检测方法与指标

1.6.1 苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色与肺组织损伤评分 将固定好的大鼠肺组织切割组织块，至厚度约0.5 cm，常规组织梯度乙醇脱水、透明、浸蜡、包埋、连续切片，行HE 染色。 光镜下观察肺组织病理学变化，并按MIKAWA等[6]方法进行肺损伤评分。评分标准如下：对肺泡充血、出血、肺泡腔或血管壁中性粒细胞浸润或聚集、肺泡壁增厚和(或)透明膜形成4项指标，分别依病变轻重评分为0～4分(0分：无病变或非常轻微；1分：轻度病变；2分：中度病变；3分：重度病变；4分：极重度病变)。各项评定分数相加为肺损伤总评分。

1.6.2 血清IL-1β和TNF-α含量测定 将收集的大鼠血清严格按照酶联免疫吸附(enzyme-linked immuno serbent assay,ELISA)试剂盒说明书进行检测。

1.6.3 NF-κB免疫组织化学染色 将肺组织切片用0.1 mol·L-1磷酸盐缓冲液(phosphate buffered solution，PBS)漂洗2次，3% H2O2孵育15 min，PBS洗3次，3% Triton X-100孵育15 min。使用0.01 mol·L-1柠檬酸钠缓冲液(pH 6.0)抗原修复15 min，滴加10%正常山羊血清(PBS稀释)封闭游离的结合位点，室温20 min，以减少非特异性染色，倾去切片上血清，滴加1：500稀释的兔抗大鼠NF-κB p65多克隆抗体，4 ℃冰箱过夜。阴性对照以PBS代替一抗，4 ℃过夜。PBS洗3次，滴加生物素标记的山羊抗兔二抗工作液(1：200)，室温孵育20 min，PBS洗3次，滴加SABC，室温20 min。PBS冲洗5 min×4次。DAB显色剂显色3 min左右，自来水充分冲洗终止显色。苏木精复染30 s，分色，二甲苯透明，晾干，显微镜下观察。

1.6.4 Western blot 检测肺组织NF-κB和AP-1的表达 按细胞核蛋白提取试剂盒说明书，提取肺上皮细胞核蛋白，进行蛋白定量后，加样品缓冲液煮沸5 min，各取20 μL 加样；使用10%聚丙烯酰胺凝胶在150 V、30 mA条件下电泳1.5 h；50 V 条件下PVDF膜转膜2 h；5%脱脂牛奶封闭，滴加NF-κB p65一抗(1：50)和c-Fos、c-Jun一抗(1：50)，4 ℃过夜； 用含0.1% Tween 20 的TBS 冲洗5 min × 3次，再加入二抗(1：500) 室温下孵育2 h，用0.1%TBST 冲洗15 min×3次，ECL发光检测，X线下显影，扫描图像，测得各条带的灰度值，以β-actin为内参，比较其表达量的变化。

钢轨波浪型磨耗是指线路在投入运营后，出现在钢轨接触表面的类似波浪形的不均匀磨损。钢轨波浪形磨耗形成之后，列车行驶其上必将激励起车辆、轨道系统的振动, 而且这种振动是随着轨道不平顺的加剧而加剧的。车辆、轨道系统的剧烈振动不仅引起行李移位，使旅客舒适度降低，而且还会加速动车组车轮和轨道结构的破坏。随着我国高速铁路运营里程的增加和车次的增多，铁路现场钢轨波磨分布变得更加广泛，问题日益严重。对已经开通的高速铁路波磨成因等问题进行研究，不仅对整治已有高速铁路出现的波磨问题起到积极作用，而且对新开通和尚未开通的线路，也能起到很好的预测和防护作用。

2 结果

2.1 HE染色与肺组织损伤评分 空白对照组肺组织肺泡结构完整，无渗出。模型对照组大鼠在3 d 时显微镜下可见肺泡结构破坏，肺间质水肿，大量炎性细胞浸润。罗格列酮组中百草枯中毒的大鼠肺损伤程度明显减轻，肺损伤评分明显下降，与模型对照组比较，差异有统计学意义(P< 0.05)。见图1。

2.2 血清IL-1β和TNF-α含量测定 模型对照组大鼠血清中IL-1β和TNF-α含量呈时间依赖性增加，而罗格列酮组大鼠血清中二者表达量均明显下降，尤其在中毒1和3 d时，与模型对照组比较，差异有统计学意义。见图2。

A.空白对照组；B.模型对照组；C.罗格列酮组

2.3 NF-κB蛋白在肺组织中的表达 NF-κB在正常肺组织中支气管上皮细胞、肺泡巨噬细胞存在少量表达。模型对照组NF-κB在肺组织中表达明显增加，而罗格列酮组表达明显减少。见图3。

2.4 Western blot 检测NF-κB p65和AP-1(c-Fos、c-Jun)蛋白在肺组织中的表达 Western blot 结果提示NF-κB p65和AP-1(c-Fos、c-Jun)蛋白在正常组中仅有少量表达，而模型对照组中表达则明显增加，使用罗格列酮预处理以后二者表达明显下降(P<0.05)。见图4。

3 讨论

与模型对照组比较，*1P<0.05

A.空白对照组；B.模型对照组；C.罗格列酮组

A.电泳图；B.矩形图；与模型对照组比较，*1P<0.05

PQ造成的肺损伤除了直接的细胞毒性外，还通过生成活性氧自由基激活炎性细胞，合成并释放大量的细胞因子参与炎症反应。NF-κB是由Rel/NF-κB家族的多肽成员组成的一组转录因子，被称为是免疫炎症反应的中枢调节者[9]。通常所说的NF-κB指的是具有转录活性的p50/p65异源二聚体[10]。当细胞暴露于各种病原体时，或者在应激状态下，NF-κB便可以被激活，启动和调控多种与炎症反应有关的细胞因子(IL-1β、TNF-α等)、黏附分子和趋化因子的表达。NF-кB活化同时也导致中性粒细胞、巨噬细胞等炎性细胞数量异常增加，进一步释放大量细胞因子，造成组织损伤。然而细胞因子可以反过来进一步促进NF-кB的活化，从而形成一个正反馈环路[11]。此外，激活蛋白AP-1也参与调控很多炎性因子的表达，进而影响疾病的发展和转归[12]。AP-1 是由 c-fos 和 c-jun 蛋白组成的同源或异源二聚体。静息状态下，AP-1 的蛋白浓度和活性极低，分子结构以 c-jun 同源二聚体为主。当细胞受到刺激时，c-jun、c-fos 表达水平增高，并转变为c-fos、c-jun 异源二聚体并促进细胞因子的转录合成。动物实验研究发现大潮气量机械通气可以导致肺组织AP-1 mRNA 及其蛋白表达增加，肺组织病理损伤程度加重，可能是呼吸机相关性肺炎发生的重要因素之一[13]。

TNF-α是导致细胞或组织损伤的主要细胞因子，在局部或全身损伤后几分钟内由巨噬细胞释放，然后作用于组织细胞，使其发生溶解和死亡。IL-1β对巨噬细胞及中性粒细胞的趋化和黏附具有重要作用，增强血管通透性，能够诱导IL-6合成，下调血栓调节蛋白(thrombomodulin，TM)表达，进一步加重TNF-α导致组织损伤。本实验研究结果提示PQ中毒以后，大鼠肺泡结构破坏，肺间质水肿，炎性细胞浸润，同时也发现肺组织中NF-κB和AP-1蛋白表达增加，血清中炎性细胞因子IL-1β和TNF-α表达增加。分析升高的原因可能有两方面原因：一是PQ中毒后产生的大量氧自由基，导致其NF-κB和AP-1的激活，引起下游炎症细胞因子基因转录和表达；另一方面TNF-α、IL-1β等细胞因子的大量释放，进一步引起NF-κB和AP-1的活化。

罗格列酮是与PPAR-γ具有高亲和力的激动药，可以激活PPAR-γ在调节糖脂代谢、炎症控制和免疫调节过程中发挥关键作用[14]。PPAR-γ直接与NF-κB、AP-1以及信号转导和转录活化因子-1(signal transducer and activator of transcription-1，STAT-1) 结合形成转录抑制性复合物，从而阻止这些转录因子的活化[15]。研究发现，PPAR-γ活化可以抑制中性粒细胞浸润，抑制肺泡上皮细胞产生单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)，减少炎症细胞因子(TNF-α、IL-12、IL-6和IL-1β)的分泌，抑制巨噬细胞表达iNOS和基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)，进而抑制单核细胞在肺组织中的趋化聚集发挥抗炎作用[16]。

本实验研究结果提示罗格列酮可能通过激活PPAR-γ受体，抑制NF-κB和AP-1的活化，进而抑制炎性细胞因子IL-1β和TNF-α的表达和分泌，抑制炎症反应，减轻PQ所造成的肺组织损伤。鉴于本课题组前期研究结果[17]以及相关研究报道[18]，本实验研究采用10 mg·kg-1剂量罗格列酮对PQ中毒大鼠进行预处理，仅对其作用机制进行了初步研究。罗格列酮作为PPAR-γ激动药，与炎症抑制作用可能存在着量效关系和时效关系，需要进一步实验进行研究。

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DOI 10.3870/yydb.2015.08.002

Inhibitory Effect of Rosiglitazone on Inflammation in Paraquat-induced Lung Injury in Rats

LIU Zhenning, GAO Songlan, ZHANG Honglei, ZHAO Min

(DepartmentofEmergencyMedicine,ShengjingHospitalofChinaMedicalUniversity,Shenyang110004,China)

Objective To study inhibition effect of rosiglitazone on lung injury induced by paraquat. Methods 72 male SD rats were randomly divided into three groups (n=24)： model control group, paraquat (PQ) was administered intraperitoneally at the dose of 20 mg·kg-1； rosiglitazone group, rosiglitazone (10 mg·kg-1, ip) was administered 1 h before PQ administration； blank control group, 1 mL 0.9% sodium chloride solution was administered intraperitoneally.The concentration of TNF-α and IL-1β in serum was measured by ELISA at 4, 8 h and 1, 3 day(s) after PQ exposure.The lung injury scores and nuclear factor - kappa B(NF-κB) positive signal were investigated 3 days after PQ exposure by HE staining and immunohistochemistry, respectively.Protein expression levels of NF-κB and activating protein-1(AP-1) were also determined by using Western blotting. Results The levels of IL-1β and TNF-α in serum of PQ-treated rats were significantly increased as compared with blank control group.Rosiglitazone pretreatment reduced the degree of lung tissue injury, the levels of IL-1β and TNF-α in serum, and the protien expression levels of NF-κB and AP-1 as compared with the model control group. Conclusion Rosiglitazone can inhibit NF-κB and AP-1 protein expression in lung tissue, reduce the levels of IL-1β and TNF-α in serum after PQ exposure, and exert an inhibition effect on inflammation in PQ-induced lung injury of rats.

Rosiglitazone；Paraquat；Injury, lung；Nuclear factor-kappa B；Activating protein-1； Inflammation

2014-06-16

2014-10-15

*国家自然科学基金资助项目(81171793)；辽宁省教育厅高等学校科学研究一般项目(L2014300)

刘振宁(1981-)，男，辽宁大连人，讲师，博士，研究方向： 急性药物中毒的基础与临床研究。电话：024-96615-64113，E-mail： liuzn999@hotmail.com。

赵敏(1961-)，女，辽宁沈阳人，教授，博士，研究方向： 急性药物中毒和危重病。电话：024-96615-64131，E-mail： zhaom@sj-hospital.org。

R977.15；R563.1

A

1004-0781(2015)08-0993-05