华根霉在酿酒中的研究进展*

窦晓，杨建刚，马莹莹，林秋，林艳，吴赫川

(四川理工学院生物工程学院，四川 自贡，643000)

华根霉(Rhizopus chinonsis)属于接合菌亚门(Zygomyotina)、接合菌纲(Zygomycetes)、毛霉目(Mucorales)、毛霉科(Mucoaceae)、根霉属(Rhizopus ehrenberg)［1］，在我国的酒药和酒曲中广泛出现。菌落疏松扩散，初期白色，后变褐色。假根不发达，短小，手指状。孢子囊柄常直立，光滑，浅褐色至黄褐色。孢子囊球形或近似球形，灰黑褐色至黑色，能产生球形、椭圆形或短柱形的厚垣孢子。此菌耐高温，发育温度15～45℃，最适宜生长温度为30℃［2］，由于其耐高温(45℃能生长)的特性为其扩大工业应用提供了基础，在传统和现代发酵工业中有着重要的应用。华根霉多出现在我国的酒药和酒曲中，可产生淀粉酶、耐酸性木聚糖酶、脂肪酶以及蛋白酶等。淀粉酶可以使底物中的淀粉降解为糊精和一些低分子糖，如葡萄糖、麦芽糖等;脂肪酶可以催化酸和酒精合成酯类物质对酒的香气成分形成具有重要影响。另外一些书上谈到，华根霉还具备一定的酒化能力［2］。而它产生的糖化酶和脂肪酶活性较高在发酵应用中有着重要作用也是近年来研究的热点。

1 酒曲中华根霉的分离与培养

刘云秀等人对华根霉纯种的初步分离做了详细研究，具体做法是:取酒曲1.0 g于装有100 mL无菌生理盐水的三角瓶中，经两次平板分离后进行斜面培养，然后采用1株1瓶的方法进行初筛，经镜检后再进行第3次平板分离，然后在经过1次复筛和平板分离后，再进行1次复筛(1株3～5瓶)，最后选出较优菌株进行保藏。根据华根霉的生长特性他们设计了5种培养基进行分析比较分别是蔡氏培养基、麦芽汁培养基、豆芽汁培养基、改良的马铃薯培养基以及马铃薯蔗糖培养基，最后得出培养纯种华根霉的最适培养基是改良的马铃薯培养基［3］。

2 华根霉在酒类发酵中产酶特性的研究

2.1 对华根霉产淀粉酶方面的研究进展

淀粉酶也称淀粉水解酶，它是能分解淀粉糖苷键的一类酶的总称。包括α-淀粉酶、糖化酶、异淀粉酶、麦芽糖酶等。华根霉产糖化酶活力较强，也可产α-淀粉酶［4］。糖化酶(amyloglucosidase)又称糖化淀粉酶、淀粉葡萄糖糖苷酶和糖化型淀粉酶。糖化酶在作用于淀粉时，能从淀粉分子的非还原性末端逐一将葡萄糖分子切下并将葡萄糖分子构型从α-型转变为β-型，它既可水解 α-1，4-糖苷键也可以水解 α-1，6-糖苷键。因此糖化酶作用于直链淀粉或者支链淀粉是能将它们完全水解为葡萄糖［5］。华根霉的淀粉酶液化能力很强，在酿酒发酵过程中常为底物液化提供动力。在已知的各类酒曲中常常可以分离出性状优良的华根霉菌株。

刘芳等人为了得到产淀粉酶活力较高的华根霉，对甜酒小曲中分离出的华根霉菌株进行筛选。将筛选出的糖化力和液化力最强的菌株进行紫外线诱变处理，得到了比原菌株酶活力更高的优良菌株，其糖化力和液化力分别比原来菌株高出30%和12.5%，且遗传特性稳定。此菌株的应用不仅使甜酒的风味更足也缩短了发酵的糖化时间［6］。另外他们还通过正交试验和单因素实验对该菌株的产酶条件进行优化研究，得到了此菌株产淀粉酶的最佳条件，使得到的菌株产淀粉酶的活力进一步提高，此时的淀粉酶活力比优化前提高了60.96%［7］。汪彬彬研究了利用Plackett-Benhnken法和Box-Benhnken Design实验设计法优化华根霉产糖化酶发酵培养基，测定出在通过培养基培养华根霉时影响其产糖化酶活的最显著的3个因素分别是橄榄油、酪蛋白和麦麸。再对这3个因素进行最陡爬坡实验筛选出主要因素的中心点，确定出产糖化酶最大值点此时橄榄油0.01%，酪蛋白8.14%，麦麸 4.32%，糖化酶活比优化前提高了81%;在此基础上又通过响应面法对时间、温度、接种量、培养基初始PH值等各因素显著性和交互作用进行分析最后得出最佳培养条件为，时间为71.94，温度为31.99℃，接种量为11.94%，pH值为6.06此时培养基培养的华根霉产糖化酶的酶活又提高了30%［8］。

李彧娜研究了微孢根霉华根霉变种CICIM F0088的生淀粉酶系。分别对华根霉菌株在固态和液态两种发酵方式下产生的淀粉酶系进行比较研究。她通过对固态发酵和液态发酵所产生的淀粉酶进行分离纯化，结果在固态发酵产物中分离得到3个酶蛋白GAA，GAB和AA，在液态发酵产物中得到2个酶蛋白GAC和GAD。然后对这5种淀粉酶的酶学性质进行分析得出GAA、GAB无论在耐热性上还是在pH耐受范围上均优于GAC、GAD。这4种淀粉酶均有一定的生淀粉水解能力，但AA不具备。考虑到真菌淀粉酶系的复杂性，在分离纯化过程中会遗漏一些小产量的淀粉酶，李彧娜根据根酶属产葡萄糖淀粉酶的氨基酸保守序列和微孢根霉的密码子偏好性等信息设计出兼并引物，然后再通过PCR和反向PCR技术获得了该菌株完整的淀粉酶编码基因gluE。通过对比分析发现gluE是一个新的葡糖糖淀粉酶，在此基础上运用基因工程手段将gluE的cDNA联入表达载体，构成重组质粒并成功实现了异源活性表达，发现表达后的重组酶蛋白具有水解生淀粉的能力［9］。总体上来看华根霉在发酵过程中有较好的糖化能力，在此基础上我们可以通过诱导突变和优化培养条件等方法使其的糖化能力得到进一步加强，为工业生产提供更有力的支撑。

2.2 对华根霉产脂肪酶方面的研究进展

脂肪酶作为一种在异相系统即在油水界面起催化作用的特殊酯键水解酶，作用底物主要为天然油和脂肪，水解产物为甘油二酯、甘油单酯、甘油和脂肪酸。脂肪酶在白酒制曲和发酵期间，可以水解原料中所含的脂肪，使原料中的淀粉充分接触酵母，促进发酵代谢进程;同时产生有机酸和甘油，而有机酸是白酒最好的呈味剂，可以使酒的口味丰富而不单一，增长酒的后味，如酸量适度、比例协调，可使酒出现甜味和回甜感。甘油作为一种多元醇助香剂，可以消除糙辣感，增加白酒的醇和度。更重要的是，脂肪酶同时还可以催化有机酸与大量存在的乙醇生成己酸乙酯、乙酸乙酯等酯类香味物质，从而提高白酒中酯类香味物质的含量，加快白酒中各种酸、醇、酯的反应平衡，缩短贮存老熟时间，调节白酒中各种香味物质的含量和比例，提高白酒品质［10］。

由于脂肪酶在工业上的巨大利用价值，而微生物作为脂肪酶的主要来源，一直是科学界研究的重点。孙舒扬研究优化了华根霉产全细胞脂肪酶在固体培养基上培养的条件，确定了其脂肪酶具有较强的短链酯的合成能力且对辛酸乙酯和己酸乙酯的转化率可高达95%;另外还发现华根霉CCTCCM201021在固态发酵过程中产生的脂肪酶的合成活力和水解活力存在不对应性，并首次采用水解活力和合成活力2种纯化标准对华根霉产生的脂肪酶进行纯化，并对分离纯化的2种同工酶的一些性质进行了研究;发现橄榄油不仅是华根霉生长的碳源也是合成脂肪酶和水解脂肪酶的双重诱导物［11-12］，而滕云进一步研究了油脂对华根霉产脂肪酶的影响发现其对脂肪酶的水解酶活和合成酶活的影响并不相同，底物中油脂的存在与否对水解酶活影响并不大，但对其合成酶活来说就变得至关重要［13］;颜兴和研究了华根霉有机相的合成酶活，通过对7种脂肪酶的合成酶活、水解酶活以及在正庚烷中催化合成己酸乙酯的能力证明了脂肪酶的水解酶活和合成酶活关联性不强的结论，并且得出合成酶活更能反映脂肪酶的合成能力，合成酶活高的脂肪酶催化脂合成的能力也越强［14］;周艺博研究发现华根霉菌体的聚集有利于其膜结合脂肪酶发酵水平的提高。他在摇瓶水平上研究了发酵液初始量、接种量、挡板条件、装液量、摇床转速以及橄榄油的添加量对华根霉菌体形态的的影响并得出块状菌体的形成条件，王栋和滕云也在相关方向做了研究［15-17］;朱增亮、王栋等人通过对发酵装置的改进实现了促进华根霉菌体在7 L发酵罐中的聚集也提高了菌体对橄榄油的利用效率［18-19］。

目前国内外已报道了多个根霉脂肪酶基因序列，其中已报道的Rhizopus stolonifer和Rhizopus oryzae脂肪酶基因的同源性达到80%以上。日本、德国先后用大肠杆菌、酿酒酵母和巴斯德毕赤酵母成功表达出米根霉脂肪酶基因，但国内外对华根霉脂肪酶分子水平研究较少。王乐乐通过PCR技术首次克隆出了华根霉CCTCCM20021脂肪酶的全基因，其可以编码一个由389个氨基酸残基组成的蛋白质，其中26个氨基酸由信号肽编码，前导序列编码94个氨基酸，成熟肽编码269个氨基酸。然后通过基因工程手段构建产脂肪酶的前导肽和成熟肽的重组质粒，并且把重组质粒导入到巴斯德毕赤酵母中进行表达用SDSPAGE分析表达的前肽脂肪酶的最大表达量为0.85 mg/mL，占蛋白分泌总量的68.3%，用PPNP法测得的脂肪酶水解酶活为121.2 U/mL;而成熟肽最大表达量为0.16 mg/mL，占分泌总量的21.6%，脂肪酶水解酶活为4.3 U/mL。进一步研究发现表达的两种脂肪酶都未进行N末端糖基化修饰，两种酶的最适反应温度及pH相近，但底物选择性和动力学常数相差较大，且它们在异辛烷、正己烷和正庚烷中都表现出良好的稳定性和较高的活力［20］。

2.3 华根霉产其他酶的一些研究进展

华根霉在发酵中主要产淀粉酶和脂肪酶，除此之外研究还发现它还可以产耐酸性木聚糖酶和纤溶酶等。耐酸性木聚糖酶可以水解米粒淀粉层外围的木聚糖，提高淀粉的利用率，而纤溶酶主要是水解纤维蛋白的酶类。陆健、曹钰和陈坚等人在国内首次对中国酒曲中分离出来的华根霉产生的耐酸性木聚糖酶进行纯化，并和米曲霉和白曲霉产生的耐酸性木聚糖酶进行比较。分析发现米曲霉产生的木聚糖酶在促进米细胞溶解和提高原料米的利用率方面效果更优［21］;迟文鹤和王海宽等对华根霉产纤溶酶的工艺优化和发酵条件等方面进行了研究，优化了产酶条件［22-23］。我们知道，米粒有谷皮、糊粉层、胚乳和胚四部分构成，其中谷皮有果皮和种皮复合而成，其主要成分是纤维素和灰分，而糊粉层和胚里面都富含有蛋白质和脂肪等。米粒的这些部位所含有的物质不仅不利于酒体的酿造，还会影响酒的品质，而根据目前的研究来看，华根霉所产的脂肪酶，木聚糖酶和纤溶酶等可以对这些有害物质的降解产生积极的作用。

3 华根霉对酒类风味物质的贡献

华根霉在酿酒发酵中的主要作用除了提供糖化力和液化力之外，也为酒类风味物质产生做出了主要贡献。它可以产生乳酸和脂肪酶，另外一些书籍上也说华根霉可以产酒精。

华根霉可以产乳酸等有机酸，乳酸是酿酒过程中重要的物质，它可以与乙醇结合生成酒类的重要风味物质乳酸乙酯。周小楠以一株野生型的产L-乳酸的华根霉为出发菌，研究了该菌株适宜产酸的条件，并以10keV氮离子对出发菌进行诱变获得了高产L-乳酸的华根霉突变菌株［24］。

华根霉可以产脂肪酶。脂肪酶不仅可以水解发酵底物中的油脂等，还可以催化分解底物时产生的酸和酒精合成酯类，而酯类是酒中重要的增香物质，对酒类风味的形成至关重要。前面孙舒扬，周艺博等对华根霉产脂肪酶各方面特性进行了深入研究，另外崔如生等人利用华根霉产脂肪酶具有合成己酸乙酯能力的特性制出了一种新的调味酒，用这种调味酒制成的勾兑酒比市面上一般勾兑酒的酒质要好［25-26］。孙舒扬通过实验确定了华根霉产全细胞脂肪酶具有合成乙酯类风味物质的能力，且对辛酸乙酯和癸酸乙酯的转化率可高达95%［27］。

4 华根霉在酒曲中的应用

华根霉作为一种在酿酒工业中应用比较广泛的微生物，在很多酒曲中都能找到它的影子，尤其是在小曲中根霉的作用更为显著。在大曲中存在的根霉分为黑根霉、米根霉、华根霉、无根根霉几种。除具有假根的特征外，主要和毛霉、酵母菌共存。在制曲过程中，曲块表面用肉眼可以观察到的形状如同网状似的菌丝体就是根霉［4］。华根霉菌丝初为白色，随着大曲发酵的品温不断上升和水分的挥发变为灰褐色或黑褐色。如果用显微镜观察可明显看到其孢子囊;华根霉和曲霉一样随着发酵的深入，菌丝插入到大曲的基质中去。但大曲中的根霉主要是米根霉，华根霉较少。小曲中所含的微生物主要是霉菌和酵母菌，而霉菌主要是根霉。其中常见的根霉有河内根霉，米根霉，日本根霉，爪哇根霉，华根霉等。各菌种之间主要是适应性、生长特性、糖化力强弱以及代谢产物上有所差别。目前生产上常用的根霉菌株为河内根霉AS3.866、白曲根霉、米根霉和Q303根霉等［4］。华根霉也在一些研究中发现。曾令琴，葛毅强等人通过对泰国甜酒曲中的优势真菌进行分离纯化培养，鉴定出泰国甜酒曲中的优势菌株为华根霉和米根霉以及假丝酵母属的酵母菌［1］。通过进一步研究发现分别用米根霉和华根霉做甜酒曲与Q303根霉相对照表明，这两种酒曲的液化力均不及Q303，做出的甜酒与Q303相比色泽更好但风味稍差［28］。陈晓芸对广东客家酿酒酒曲微生物进行鉴定分离得出兴宁地区的酒曲以酒香酵母属和华根霉为主，河源地区酒曲微生物以米根霉和假丝酵母属为主并且通过比较发现兴宁地区酒曲产酒率和糖度要高于河源地区，兴宁地区的酒品质更好［29］。

5 华根霉在新型勾兑酒方面应用的研究

新型勾兑酒是指以优质酒精为基础酒，经调配而成的各种白酒。新型勾兑酒具有无色透明，香味协调、自然，口味干净，具有特定的风格等特点。相对于酿造酒来说勾兑酒自身具备很多优点，目前在市场上占有很大的份额。例如，节约粮食，增香原材料丰富，含高级脂肪酸脂少，工艺简单，适应市场经济变化等。另外随着各种新香料物质的发现和新勾兑技术的不断创新，使得勾兑酒很有可能成为未来白酒的主体类型。由于种种原因，我国的勾兑酒目前存在2个突出问题:一是杂质含量高，二是香味成分不纯。这是阻碍勾兑酒发展的2个突出问题。崔如生和徐岩为解决市场上勾兑酒存在浮香突出，质量不稳定等问题，研究出利用R92华根霉生物酯化技术生产香料物质制成调味酒来代替化工合成香料的方法。他们在研究时发现R92华根霉的己酸乙酯合成能力特别强，单纯的利用己酸和乙醇作原料中试出来的结果表明己酸乙酯含量很高，但乳酸乙酯和其它微量物质含量偏低，造成酯化液口感单一，己酸味突出。然后他们在生产中又添加了黄水，酒头和酒糟等物质，丰富了酯化液中其它微量物质的含量。结果表明，通过这种方式做出来的酯化液含有大量的酸脂等微量物质，用此做调味酒生产的46%Vol洋河试验酒比市场上的销售的中档酒在微量成分的数量和含量上都要高，并且品尝等级分也高于市售中档酒，成功解决了市售勾兑酒的浮香问题，找到了改善勾兑酒质量的新方法［25-26］。

6 结语

华根霉在制曲和酿酒方面都发挥着作用，它所产的糖化酶活性很强，是酿造工业中常用的糖化菌;能产生酒精、脂肪酶类、乳酸等，常可以增加酿造酒的风味。华根霉的脂肪酶在酒类发酵中合成己酸乙酯、乳酸乙酯等乙酯类香味物质的能力较强，但如果单纯用华根霉做纯种曲酿造出的酒口味较单一，还需借助其它菌或者添加其他风味物质才能克服自身的不足。另外，对于华根霉在酿酒发酵中的单独作用研究的还相对较少，在灵活应用自身特性方面也还有许多需要进一步探究的地方:

(1)通过现代生物技术在DNA分子水平上不断开发和利用华根霉在酿酒中的优良特性，发挥其更大的作用将需要更多的研究工作。

(2)结合华根霉菌体自身的生理特性和产酶特性来看，在固态发酵中，更适宜其菌体的生长和酶活的提高。因此在研究酒类的固态发酵时，华根霉具有更多的利用价值。

(3)利用华根霉产脂肪酶具有高活性的产乙酯类物质的能力结合现代勾兑技术和酿酒工艺的不断进步，华根霉可在研制新型勾兑酒方面发挥更大的作用。

(4)在深入研究华根霉和其他菌株特性的基础上，利用它们的互利关系，取长补短，发挥各自的优势进行有规律的混合发酵，生产出成本更低，质量更优异的产品将会具有很大的市场空间。

(5)由于华根霉产生的淀粉酶具有水解生淀粉的能力，可以考虑利用华根霉进行生料发酵，这将对降低企业的生产成本很有帮助。

［1］ 曾令琴，葛毅强，周传云.泰国甜酒区中优势真菌的分离鉴定初报［J］.中国酿造，2005(8):19-21.

［2］ 李艳.发酵工程概论［M］.北京:中国轻工业出版社，2011:17.

［3］ 刘云秀，刘清斌，周健.华根霉纯种筛选的初步研究［J］.四川食品与发酵，2003(3):31-34.

［4］ 沈怡方.白酒生产技术全书［M］.北京:中国轻工业出版社，2007.

［5］ 李祥.食品添加剂使用技术［M］.北京:化学工业出版社，2007.

［6］ 刘芳，曹新志，任晓华.甜酒曲华根霉淀粉酶菌株紫外线诱变育种［J］.中国酿造，2009(7):78-80.

［7］ 刘芳，曹志新，游见明.甜酒曲华根霉淀粉酶菌株产酶条件的研究［J］.中国酿造，2011(5):134-136.

［8］ 汪彬彬，车振明.Plackett-Burman和Box-Benhnken Design实验设计法优化华根霉产糖化酶-发酵培养基的研究［J］.食品科技，2011(5):41-45.

［9］ 李彧娜.微孢根霉华根霉变种CICIM+F0088生淀粉酶系的研究［D］.无锡:江南大学，2010.

［10］ 胡国华.食品添加剂使用技术［M］.北京:化学工业出版社，2012:11.

［11］ 孙舒扬.华根霉产合成脂肪酶同工酶在固态发酵中的生产纯化及性质研究［C］.无锡:江南大学，2006:672-676.

［12］ 孙舒扬，王栋，徐岩.固液态发酵中橄榄油对Rhizopus chinensis全细胞脂肪酶的影响［J］.微生物学通报，2006，33(4):10-14.

［13］ YUN T，XU Y，DONG W.Production and regulation of different lipase activities from Rhizopus chinensis in submerged fermentation by lipids［J］.Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic，2009，57(1-4):292-298.

［14］ 颜兴和，王栋，徐岩.华根霉脂肪酶有机相合成酶活的研究［J］.工业微生物，2005，35(2):24-28.

［15］ 周艺博，王栋，徐岩，等.华根霉合成活性脂肪酶液态发酵菌体形态调控的研究［J］.工业微生物，2011，41(5):11-15.

［16］ 周艺博.基于Western+Blot分析的华根霉液态发酵菌体形态与其膜结合脂肪酶生产间规律的研究［D］.无锡:江南大学，2010.

［17］ YUN T，XU Y，WANG D.Changes in morphology of Rhizopus chinensis in submerged fermentation and their effect on production of mycelium-bound lipase［J］.Bioprocess Biosyst Eng，2009，32(3):397-405.

［18］ WANG D，XU Y，SHAN T Y.Effects of oils and oil-related substrates on the synthetic activity of membrane-bound lipase from Rhizopus chinensis and optimization of the lipase fermentation media［J］.Biochemical Engineering Journal，2008，41(1):30-37.

［19］ 朱增亮，王栋，徐岩.发酵罐装置改进提高华根霉膜结合脂肪酶液态发酵水平［J］.工业微生物，2013，43(2):6-11.

［20］ 王乐乐.华根霉(Rhizopus chinensis)脂肪酶的基因克隆、表达，纯化和酶学性质研究［D］.无锡:江南大学，2008.

［21］ 陆健，曹钰，陈坚，等.耐酸性木聚糖酶在清酒酿造中的作用［J］.食品与发酵工业，2001，28(1):27-30.

［22］ 迟文鹤，王海宽，路福平，等.华根霉固态发酵产纤溶酶的工艺优化和初步提纯［J］.天津科技大学学报，2005，20(3):5-8.

［23］ 王海宽，刘建军，宋馨宇，等.华根霉产纤溶酶液体发酵条件的研究［J］.工业微生物，2011，41(2):7-10.

［24］ 周小楠.低能离子诱变选育华根霉高产L-乳酸菌株的研究［D］.合肥:安徽农业大学，2006.

［25］ 崔如生，徐岩.应用R92华根霉生产调味酒提高新型白酒质量［J］.酿酒，2007，34(1):27-30.

［26］ 崔如生，徐岩.Rhizopus chinesis在新型白酒中的应用［J］.酿酒，2007，34(2):16-23.

［27］ SUN S Y，XU Y.Solid-state fermentation for‘whole-cell synthetic lipase’production from Rhizopus chinensis and identification of the functional enzyme［J］.Process Biochemistry，2008，43(2):219-224.

［28］ 曾令琴，葛毅强，周传云，等.泰国优质甜酒曲中根霉发酵特性的研究［J］.食品科技，2005(3):14-16.

［29］ 陈晓芸.广东客家娘酒传统酿造工艺研究及主要酒曲微生物的分离和特性［D］.南昌:南昌大学，2011.