姜黄素对肺癌细胞的放疗增敏作用及机制研究

林清认，周霞

（浙江省肿瘤医院 放疗科，浙江 杭州 310022）

姜黄素对肺癌细胞的放疗增敏作用及机制研究

林清认，周霞Δ

（浙江省肿瘤医院 放疗科，浙江 杭州 310022）

目的观察姜黄素对肺癌NCI-H446细胞的体外放疗增敏作用，探讨其可能的机制。方法体外培养肺癌NCI-H446细胞，分为对照组、姜黄素处理组、X射线干预组以及联合干预组。对照组仅给予等体积培养基，姜黄素处理组给予不同浓度姜黄素处理48 h，X射线组采用X射线照射（剂量率250 cGy／min），联合治疗组细胞先采用姜黄素处理，之后使用X射线照射。采用MTT法检测各处理组细胞增殖情况，流式细胞术检测细胞凋亡，Western blot检测细胞中p53、p21、Bax、Bcl-2蛋白表达。结果不同浓度的姜黄素对人肺癌NCI-H446细胞生长具有抑制作用；剂量为6～12 Gy的X线处理后，也可显著抑制NCI-H446细胞增殖；不同浓度姜黄素和8Gy X线处理后，NCI-H446细胞增殖进一步降低，并与姜黄素浓度呈一定的剂量依赖性。流式细胞术结果显示：姜黄素和X射线照射均可促进细胞凋亡；2者联合使用与单纯姜黄素或X射线照射相比细胞凋亡显著增加，差异均有统计学意义（P＜0.05）。Western blot结果显示：姜黄素与X射线均能诱导NCI-H446细胞中p53、p21和Bax蛋白表达，降低Bcl-2蛋白表达（P＜0.05）。X射线与姜黄素联合处理后，p53、p21和Bax以及Bcl-2蛋白含量比单独作用变化显著，差异有统计计学意义（P＜0.05）。结论姜黄素对人NCI-H446细胞具有放疗增敏作用，其机制与诱导细胞凋亡，上调p53、p21蛋白及下调Bcl-2／Bax表达有关。

姜黄素；肺癌细胞；放疗

1 材料与方法

1.1 主要实验试剂与仪器 姜黄素（Sigma-Adrich，纯度≥95%），用二甲基亚砜（DMSO）溶解；细胞培养基购自Invitrogen公司、细胞蛋白提取试剂盒购自 Thermo；碘化丙啶（PI）购自Sigma-Adrich，抗人 p53、p21、Bax和 Bcl-2抗体购自 Santa Cruz；ECl化学发光试剂盒购自Amersham Pharmacia公司；MTT试剂盒购自江苏碧云天生物技术有限公司。主要仪器：流式细胞仪（FACSCalibur system，BD），分 光 光 度 计 （BioPhotometer spectrophotometer，Eppendorf），医 用 加 速 器 （Clinac 600 C／D，Varianmedical systems）。

1.2 细胞培养及活性检测 人小细胞NCI-H446肺癌细胞株（中南大学肿瘤研究所提供）用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基于37℃，5%CO2条件下培养。分别设立对照组、姜黄素处理组、X射线干预组以及联合干预组。对照组不做处理，姜黄素处理组给予25μmol／L处理48 h，X射线组采用X射线照射（剂量率250 cGy／min），联合干预组给予不同浓度姜黄素和X射线。MTT法检测姜黄素对NCI-H446细胞增殖的影响。取不同浓度姜黄素和不同剂量X射线处理后的NCI-H446细胞，每孔加入30μLMTT溶液（1 g／L），37℃孵育 2 h后弃上清，加入200μL DMSO，充分混匀，用酶标仪测定各孔吸光度值（A570），计算抑制率。抑制率＝（对照组A值-实验组A值）／对照组A值×100%。取抑制率为20%～30%时的姜黄素浓度和射线剂量进行后续实验。

1.3 细胞凋亡检测 NCI-H446细胞孵育结束后，弃上清，PBS轻洗2次，重悬制备单细胞悬液，计数并调整细胞密度至5×105个／mL。取1mL细胞，1 000 r／min离心 5 min，离心弃上清；用195μL Binding Buffer轻重悬并加入5μL Annexin-V／FITC轻混匀，室温避光孵育 10 min；1000r／min离心 5 min，沉淀加入190μL Annexin-V／FITC结合液轻重悬细胞，再加入10μL PI轻轻混勾，冰浴避光反应10min后用于流式细胞术分析。

1.4 Western blot 细胞处理完毕后，800 r／min离心5 min，弃上清，用冰冷的PBS洗涤细胞2次。加入200μL细胞裂解缓冲液重悬浮细胞，冰上裂解40min。1 000 r／min离心15min后，上清即为细胞总蛋白。对于细胞浆蛋白提取，将细胞沉淀每20 μL细胞沉淀的体积，加入200μL预冷的溶液A工作液，最大转速涡旋剧烈振荡10 s。放置冰上10～15 min。随后加入11μL冷溶液B，涡旋剧烈振荡5 s，冰上裂解1min。再次振荡5 s后，4℃离心5min。上清即为细胞浆蛋白。上述蛋白经5%～15%SDS-PAGE后，Western blot检测 p53、p21、Bax和 Bcl-2的表达。

1.5 统计学方法 采用SPSS10.0统计软件分析数据，计量资料采用单因素方差分析，两组间比较用t检验；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度姜黄素对NCI-H446细胞增殖的影响 阴性对照组NCI-H446细胞增殖活跃。用不同浓度的姜黄素作用24～72 h后，NCI-H446细胞增殖均受到不同程度的抑制（见图1）。根据Kärber法，24 h姜黄素的半数抑制浓度（IC50）为224.5μg／mL，48 h的 IC50为64.3μg／mL。选取48 h NCI-H446细胞抑制率为20%～30%的姜黄素浓度（20μmol／L）进行后续试验。

图1 不同浓度姜黄素对NCI-H446细胞的生长抑制作用Fig.1 Effect of different concentration of curcumin on the viability of NCI-H446 cell

2.2 不同剂量X射线对NCI-H446细胞增殖的影响 当辐射强度在12 Gy以内时，随着射线强度的增加以及照射时间的延长，对NCI-H446细胞的抑制率也进一步增加（见图2）。24 h辐射的IC50为18.4Gy，48 h的IC50为14.8Gy，选取抑制率为20%～30%时的辐射剂量（8 Gy）用于下一步实验。

图2 不同强度X线对NCI-H446细胞的生长抑制作用Fig.2 Effect of different intensity of X-ray on the viability of NCI-H446 cell

2.3 姜黄素对NCI-H446细胞的放射增敏作用 MTT结果显示：8Gy X射线组处理48 h时对NCI-H446细胞生长抑制率为（27.8±3.4）%。分别用 5、10、20μmol／L浓度姜黄素联合干预后，肺癌NCI-H446细胞的增殖抑制率随着姜黄素浓度的增加逐渐升高，与单用姜黄素组、X射线组比较，差异均有统计学意义（P＜0.01，见图3）。

图3 不同强度X线和姜黄素对NCI-H446细胞的生长抑制作用**P＜0.01，与20μmol／L姜黄素相比；＃＃P＜0.01，与8 Gy X-射线相比Fig.3 Effect of different intensity of X-ray and curcumin on the viability of NCI-H446 cell**P＜0.01，compared with 20μmol／L curcumin；＃＃P＜0.01，compared with 8Gy X-ray

2.4 姜黄素联合X射线对NCI-H446细胞凋亡的影响 流式细胞术结果显示：尽管姜黄素处理48 h和8 Gy X射线处理均可促进NCI-H446细胞凋亡，但2者联合处理后，随着姜黄素浓度的递增，凋亡抑制率逐渐增高，与单用20μmol／L姜黄素或8Gy射线相比，差异均具有统计学意义（P＜0.05，见图4）。

图4 不同强度X线和姜黄素对NCI-H446细胞凋亡的影响*P＜0.05，与 20μmol／L姜黄素相比；＃P＜0.05，与 8Gy X-射线相比Fig.4 Effect of different intensity of X-ray and curcumins on NCI-H446*P＜0.05，compared with 20μmol／L curcumin；*P＜0.01，compared with 8 Gy X-ray

2.5 凋亡相关蛋白含量检测 Western结果显示放射线及姜黄素均能增加NCI-H446细胞p53、p21、Bax和Bcl-2蛋白的表达（P＜0.05）。而 2者联合使用后，p53、p21、Bcl-2／Bax比值比单独应用的表达上升，作用显著（P＜0.01，见图5）。

图5 不同强度X线和姜黄素对NCI-H446细胞凋亡基因表达的影响1.20μmol／L姜黄素；2.8 Gy X射线；3.8 Gy X射线 ＋5μmol／L姜黄素；4.8 Gy X射线 ＋10μmol／L姜黄素；5.8Gy X射线 ＋20μmol／L姜黄素*P＜0.05，与 X-ray组相比Fig.5 Effect of different intensity of X-ray and curcumin on apoptosis genes of the NCI-H4461.20μmol／L curcumin；2.8 Gy X-ray；3.8 Gy X-ray＋5μmol／L curcumin；4.8Gy X-ray＋10μmol／L curcumin；5.8Gy X-ray＋20μmol／L curcumin*P＜0.05，compared with X-ray group

3 讨论

放疗是肺癌的重要辅助治疗方式。早在上个世纪五六十年代就有研究发现一些硝基咪唑类化合物可有效增强放疗的效果，但由于其神经毒性太大而未能广泛应用于临床。随后又发现甲硝唑等一些化疗药物也能产生增敏效果，但依然因为不良反应太大而使其应用受到了限制［7-8］。因此寻求低毒的放疗增敏剂，对于肺癌的治疗非常重要。近年来姜黄素在肿瘤中的应用受到众多学者的关注。药理学研究表明，姜黄素具有明确的抗肿瘤效应，包括影响细胞周期、诱导细胞凋亡、抑制血管发生、降低肿瘤细胞迁移与侵袭相关酶类的表达，并对耐药性肿瘤细胞有一定的逆转作用［9-10］。以上药理作用是本研究选择姜黄素用于放疗增敏剂的重要理论依据。

本研究首先通过MTT法对X射线和姜黄素作为单独处理因素对NCI-H446细胞增殖与凋亡进行了探讨。结果表明姜黄素能以剂量和时间依赖性方式抑制NCI-H446细胞生长增殖。与姜黄素类似，X射线的一定剂量下，也具有类似的抑制效应。随后根据姜黄素或X射线对细胞抑制率为20%～30%的浓度进行了联合干预，结果显示，在X射线强度一致的情况下，细胞增殖抑制率以及凋亡率随姜黄素浓度的增高而增加，较单纯X射线或单纯药物处理差异有统计学意义。初步显示出了姜黄素对小细胞肺癌NCI-H446细胞的放疗增敏效应。

为进一步探讨姜黄素与放疗诱导NCI-H446细胞凋亡的机制，本研究对抑癌基因p53和p21进行了检测。细胞内p53蛋白是最重要的抑癌基因，尤其是在修复DNA完整性方面发挥重要作用，防止癌变细胞的发生［11］。p21是位于p53基因下游的细胞周期素依赖性激酶抑制因子，与p53共同构成细胞周期检测点，从而阻滞细胞进行正常有丝分裂，减少受损DNA复制，抑制细胞恶性增殖［12］。本研究证实，姜黄素和放疗均可增加NCIH446细胞中的p53和p21蛋白的含量，2者联合处理后，它们的表达量与单纯X射线与姜黄素处理相比增加更显著（P＜0.01）。由此推测姜黄素对肺癌细胞的放疗增敏作用可能与上调抑癌基因p53和p21蛋白表达有关。

肿瘤治疗的最终目标是诱导其凋亡，在参与凋亡的众多调节蛋白中，Bcl-2基因家族发挥着重要作用。Bax是该家族中重要的促凋亡蛋白，其可与Bcl-2结合形成异二聚体，从而抑制Bcl-2活性。通常以 Bcl-2／Bax的比值来反应细胞凋亡情况［13-15］。本研究发现，与对照组相比，姜黄素或放射组细胞中Bcl-2蛋白含量明显减少，Bax蛋白含量明显增加（P＜0.05）。姜黄素与放射联合处理后，NCI-H446细胞中Bcl-2／Bax比值明显降低（P＜0.01）。

综上所述，本研究证实姜黄素对肺癌NCI-H446细胞具有一定的放疗增敏作用。其增敏机制可能与诱导细胞凋亡、以及上调p53、p2l蛋白表达、下调Bcl-2／Bax的比率有关。但具体的分子生物学机制还有待后续进一步研究。

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（编校：吴茜）

Radiotherapy sensitization role of curcum in on lung cancer cells and itsmechanism

LIN Qing-ren，ZHOU XiaΔ

（Department of Radiotherapy，Tumor Hospital of Zhejiang Province，Hangzhou 310022，China）

ObjectiveTo observe the radiosensitizing effect of curcumin on lung cancer NCI-H446 cell in vitro and to investigate the possible mechanism.MethodsLung cancer NCI-H446 cell were cultured in vitro and divided into four groups：control group，curcumin group，X-ray group and combined intervention group.Control group was given equal volume ofmedium，curcumin group was treated with 20μmol／L curcumin for 48 h，X-ray group was irradiated by X-ray（dose rate was 250 cGy／min）and combined intervention group was treated with curcumin and X-ray.The proliferation of NCI-H446 cell in all groupswere detected by MTTmethod，cell apoptosiswere detected by flow cytometry and the protein expression of p53，p21，Bax，Bcl-2 were detected by Western blot.ResultsThe growth of human lung cancer NCI-H446 cellwere inhibited with different concentrations of curcumin and 6～12 Gy X-ray irradiation，and inhibited more in combined intervention group，in curcumin dose-dependentmanner.Flow cytometry results showed that，curcumin or X-ray irradiation could all induce apoptosis，the cell apoptosis increaced significantly when treated with both（P＜0.05）.Western blot results showed that，either curcumin or X-rays could induce p53，p21 and Bax protein expression in NCI-H446 cell and decrease Bcl-2 protein expression（P＜0.05）.After the combination of X-rays and curcumin，the content of p53，p21，Bax and Bcl-2 protein was significantly changed（P＜0.05）.ConclusionCurcumin has radiosensitizing effect on lung cancer NCI-H446 cell.The mechanism is connected with the inducing of apoptosis，increasing p53，p21 protein expression and decreasing the Bcl-2／Bax ratio.

curcumin；lung cancer cell；radiotherapy

R735

A

1005－1678（2014）05－0033－04

肺癌是威胁人类生命和健康最严重的恶性肿瘤之一。美国2013年最新数据显示，肺癌死亡病例达58万，居肿瘤病死亡率的首位［1］。非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是最常见的病理类型（约占80%以上）。目前对于早期NSCLC，手术依然是主要的治疗手段，但对于无法进行手术或无法治愈的NSCLC而言，放射治疗是重要的辅助治疗手段［2］。放射治疗可提高肿瘤的局部控制率，但依然受多种因素限制：①NSCLC患者往往机体抵抗力差，对放疗剂量耐受性低［3］；②放疗受肿瘤的组织学类型的影响；③病灶周围正常组织也无法耐受大剂量的放疗。放疗联合抗肿瘤药物可提高临床疗效，但不良反应依然是临床上面临的主要问题［4-5］。因此寻求不良反应少，且能有效提高放疗疗效的药物，是一种非常有前途的方案。近年来研究发现许多中草药提取物可有效提高肿瘤细胞对放疗的敏感性，姜黄素就是其中一种［6］。本研究旨在观察姜黄素对肺癌NCI-H446细胞的放疗增敏作用，探讨其可能的作用机制。

浙江省医药卫生平台骨干人才计划（2011RCB008）

林清认，男，硕士，住院医师，研究方向：肿瘤放射治疗，E-mail：linqingren1984＠163.com；周霞，通信作者，女，本科，副主任医师，研究方向：肿瘤放射治疗，E-mail：zhouxia197612＠163.com。