前列腺源性ETS因子对HCT116细胞增殖与凋亡的影响

张毅强，师帅帅，郭改娥，苏娇，汪军梅，李惠芳

（1.长治医学院生物化学教研室，山西 长治 046000；2.长治医学院附属和济医院，肾内科，山西 长治 046000）

前列腺源性ETS因子对HCT116细胞增殖与凋亡的影响

张毅强1，师帅帅2，郭改娥1，苏娇1，汪军梅1，李惠芳1

（1.长治医学院生物化学教研室，山西 长治 046000；2.长治医学院附属和济医院，肾内科，山西 长治 046000）

目的探讨前列腺源性ETS因子（prostate-derived Ets factor，PDEF）对HCT116细胞增殖与凋亡的影响。方法体外培养HCT116细胞，分成空白对照组，空质粒组和重组表达质粒组，空质粒组转染不含PDEF的空载体，重组表达质粒组转染PDEF重组表达质粒。荧光显微镜下观察PDEF重组质粒表达情况；RT-PCR、Western blot检测3组细胞PDEFmRNA和蛋白的表达情况；CCK8法检测细胞增殖情况；流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果荧光显微镜下空质粒组和重组表达质粒组HCT116细胞均可观察到绿色荧光蛋白的表达，表明质粒已成功转染HCT116细胞；RT-PCR结果显示，与空质粒组相比，重组质粒组PDEF基因表达增高263倍；Western blot结果可见重组质粒组有PDEF蛋白的表达，而空质粒组和对照组没有；CCK8法检测发现PDEF基因的表达能够明显抑制HCT116细胞的增殖（P＜0.05）；流式细胞仪结果显示重组质粒组细胞凋亡率显著高于对照组和空质粒组（P＜0.05）。结论在HCT116细胞中表达前列腺上皮源性ETS转录因子，可以抑制细胞的增殖和促进细胞凋亡。

前列腺源性ETS因子；增殖；凋亡

1 材料与方法

1.1 材料 HCT116细胞购自中国科学院上海细胞库，RPMI1640培养基购自HyClone公司，胎牛血清购自杭州四季青生物有限公司。TRIzol及 Lipofectamine 2000脂质体购自Invitrogen公司。E.coliDH5α菌为本室自己保存。GV230（PDEF真核表达质粒）购自上海吉凯基因有限公司，质粒小量提取试剂盒购自Omega公司，CCK8购自上海Dojindo公司，AnnexinⅤ-PE标记细胞凋亡试剂盒购自南京凯基生物公司，反转录试剂盒及实时荧光定量PCR试剂盒购自TaKaRa公司。鼠抗人PDEF单克隆抗体购自Abcam公司，鼠抗人β-tublin多克隆抗体及HRP标记的山羊抗小鼠IgG购自Santa Cruz公司。ECL低背景化学发光试剂盒购自康为世纪公司。

1.2 方法

1.2.1 倒置荧光显微镜观察重组质粒在HCT116细胞中的表达：用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基培养HCT116细胞，转染前一天，以每孔1×105个细胞接种于6孔板中，培养细胞使达到70～80%融合。实验设3组，分别为空白对照组、空质粒组和重组质粒组，按照Lipofectamine 2000转染说明进行转染，转染48 h后于倒置显微镜下观察目的蛋白的表达。

1.2.2 RT-PCR检测HCT116细胞PDEF基因mRNA表达：HCT116细胞接种于6孔板中，待细胞达到70～80%融合时进行转染，转染 48 h后，用 TRIzol试剂提取细胞总 RNA，测定OD260／OD280比值，使在1.8～2.0之间。依据Takara公司提供的试剂说明进行反转录，反应体系10μL，5×PrimeScript Buffer 2 μL，总 RNA 500ng，逆转录成 cDNA，在 AB real-time PCR System中进行实时PCR分析，GAPDH作为内参，每组重复3次。PDEF引 物 F： 5′-TTACAAGAAGGGCATCATCC-3′， R： 5′-GAAGGTCAGAG CAGCAGAGC-3′，扩增产物为 188bp，GAPDH引物 F： 5′-TCCTCTGACTTCAACAGCGACA-3′， R： 5′-TTCCTCTTGTGCTCTTG CTGG-3′，扩增产物为 202 bp，引物均由上海生物工程有限公司合成。PCR循环条件为：95℃退火30 s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min。

1.2.3 Western blot检测PDEF蛋白表达：各组细胞转染72 h后，分别提取细胞总蛋白。操作方法如下：吸弃培养液，用1×PBS洗涤3次。加入RIPA裂解液，冰上裂解5 min。用细胞刮子将细胞碎片和裂解液移至 EP管中，4℃，12 000 g，离心20min，上清即为提取的总蛋白。将上清液小心转移至新EP管中，考马斯亮蓝法测定蛋白浓度，定量后分别加入5×SDS-PAGE上样缓冲液，沸水煮5min。上样进行聚丙烯凝胶电泳，半干电转将蛋白条带转移到PVDF膜（0.22μm）上，用含5%脱脂奶粉的封闭液封闭1.5 h，一抗（小鼠抗人PDEF，稀释度1∶1 000）4℃孵育过夜，HRP标记的兔抗鼠IgG的二抗（1∶1 000）二抗孵育2 h，TBST洗膜后，ECL化学发光试剂显色。

1.2.4 CCK8测定HCT116细胞增殖能力：按1.2.1中分组，转染HCT116细胞，每组以2×103个／孔（100μL／孔）的浓度将处于对数期的细胞接种到96孔板，每孔设3个对照，48 h后按照CCK-8试剂盒说明书操作，每孔加10μLCCK8，培养箱中继续培养2 h，用Thermo酶标仪在450 nm波长处，测定各孔吸光度值。

1.2.5 流式细胞术检测细胞凋亡：按1.2.1中分组，转染HCT116细胞，培养48 h后用PBS清洗细胞2次，0.25%胰酶消化细胞，按Annexin V-PE试剂盒说明书操作标记细胞凋亡，流式细胞仪检测细胞凋亡率，每管重复3次。

1.3 统计学方法 应用SPSS13.0进行统计分析，数据以“±s”表示，服从正态分布的数据，组间两两比较用Student's t检验；多组间比较，符合方差齐的，用方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 重组质粒在HCT116细胞中的表达情况 倒置荧光显微镜观察转染48 h后的细胞绿色荧光的表达情况，重组质粒组和空质粒组均可见绿色荧光，而空白对照组未见绿色荧光，说明重组质粒成功转染入HCT116细胞（见图1）。

图1 荧光显微镜观察HCT-116细胞转染图（×200）Fig.1 Transfected HCT-116 cells under fluorescencemicroscopy（×200）

2.2 RT-PCR检测HCT116细胞中PDEF基因mRNA的表达 将上述3组细胞培养48 h后分别提取总RNA，表达情况用荧光实时定量PCR技术检测，以β-tublin作为内参。经2-ΔΔCT分析可知重组质粒组与空质粒组相比，PDEF基因表达增加263倍，差异有统计学意义（P＜0.05），而空质粒组和空白对照组相比无统计学差异，说明重组质粒成功转染入HCT116细胞，并能在其中表达（见图2）。

图2 实时定量RT-PCR检测转染后HCT116细胞中的PDEFFig.2 Expression of PDEF in HCT116 cell detected by Real-time quantitative PCR

2.3 Western blot检测PDEF蛋白的表达 将转染48 h后的3组细胞分别提取其总蛋白进行Western blot检测。结果显示：重组质粒组在37 KDa左右有目的条带出现，而空质粒组和空白对照组在对应位置无条带出现（见图3）。

图3 Western blot检测PDEF蛋白在各组细胞中的表达Fig.3 PDEF protein expression by Western blot in each group

2.4 CCK8检测细胞增殖情况 与空质粒组和空白对照组相比，重组质粒组HCT116细胞的增殖明显受到抑制（P＜0.05）；而空质粒组与空白组对比细胞增殖情况没有明显差异。说明转染PDEF基因能抑制HCT116细胞的增殖（见图4）。

图4 各组细胞的吸光度值*P＜0.05，与空质粒组相比，ΔP＜0.05，与空白对照组相比Fig.4 The absorbance value of cells in each group*P＜0.05，compared with empty plasmid group；ΔP＜0.05，compared with blank control group

2.5 流式细胞术检测细胞凋亡 HCT116细胞转染48 h后流式细胞仪分析结果显示，重组质粒组细胞凋亡率为（31.13±0.93），显著高于空质粒组的（25.16±0.12）和空白对照组的（24.78±0.17），差异均有统计学意义（P＜0.05）。空质粒组和空白对照组比较差异无统计学意义（见图5）。

图5 转染不同质粒对HCT116细胞凋亡的影响Fig.5 Effects on HCT116 cell apoptosis after transfected with different plasmids

3 讨论

结直肠癌（colorectal cancer）是常见的恶性肿瘤，每年有超过100万人诊断为结直肠癌，占全球恶性肿瘤的9.4%［14］，大约四分之一的患者在发现肿瘤时已经伴有淋巴结和组织的转移，目前手术仍是结直肠癌治疗的主要手段。随着技术的进步，基因治疗逐渐成为了肿瘤的一种新的治疗方式，与术后的放化疗相比，其特异性相对强，不良反应小，因此也为肿瘤患者的治疗带来了新的希望。

PDEF是ETS家族成员，已有研究表明，其与一些肿瘤的发生发展存在一定的相关性［15-16］，这提示PDEF可能成为结直肠癌的一个潜在的治疗靶点，虽然其确切的机制目前并不是很清楚。作为一种转录因子，PDEF可调控与其结合的靶基因［17］，其表达失调会导致某些靶基因的异常调节，从而影响与细胞生长分化相关的信号转导通路，进而影响细胞的生物学行为。

本研究通过在HCT116细胞株中转染PDEF真核表达质粒，探讨了转染前后PDEFmRNA和蛋白水平的改变。转染重组质粒后，HCT116细胞比空质粒组PDEF表达水平高，而蛋白水平在对照组和空质粒组均未能检测到PDEF的表达，而转染后的重组质粒组检测到PDEF的表达。进一步的细胞生物学行为研究发现，转染重组质粒后，与对照组相比细胞的增殖被抑制，凋亡率增高。PDEF对结直肠癌作用的机制有待进一步的研究，下一步主要研究其与大肠癌发病密切相关的几个信号转导通路的关系，如 WNT信号通路［18］、TGF-β通路、PI3K通路、RTK-RAS［19］信号通路，是否通过与通路上的一些基因的相互作用，而影响癌基因或抑癌基因的表达，具体的作用机制也是下一步研究的重点。

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（编校：吴茜）

Effect of PDEF on HCT116 cell proliferation and apoptosis

ZHANG Yi-qiang1，SHIShuai-shuai2，GUO Gai-e1，SU Jiao1，WANG Jun-mei1，LIHui-fang

（1.Department of Biochemistry，ChangzhiMedical College，Changzhi046000，China；2.Department of Nephrology，Changzhi Medical College Affiliated Heji Hospital，Changzhi046000，China）

ObjectiveTo investigate the effect of prostate-derived Ets factor （PDEF） on HCT116 cell proliferation and apoptosis.MethodsHCT116 cell were cultured in vitro and divided into blank control group，empty plasmid group and the recombinant plasmid group.Empty plasmid group were transfected with empty vector without PDEF.Recombinant expression plasmid group were transfected with recombinant plasmid PDEF.The expression of PDEF recombinant plasmid were observed under a fluorescencemicroscope，the expression of PDEFmRNA and protein in three groupswere detected by RT-PCR and Western blot.HCT116 cell proliferation were detected with CCK8 assay，and HCT116 cell apoptosiswere detected by flow cytometry.ResultsThe expression of green fluorescent protein were observed in empty plasmid group and the recombinant plasmid group under a fluorescence microscope，indicating that the plasmid has been successfully transfected into HCT116 cells.RT-PCR results showed that compared with empty plasmid group，the expression of PDEF gene in recombinant plasmid group was increased 263 folds.PDEF protein expression can be detected in recombinant plasmid group，empty plasmid group and control group did not express.CCK8 results revealed that the proliferation of HCT116 cellwere inhibited by PDEF（P＜0.05）.Flow cytometry results showed that cellapoptosis rate in recombinant plasmid group was significant higher than control group and empty plasmid group（P＜0.05）.ConclusionThe expression of PDEF inhibits the proliferation of human colorectal cancer HCT-116 cell and induces apoptosis.

PDEF；proliferation；apoptosis

R73.36

A

1005－1678（2014）05－0026－04

前列腺源性转录因子（prostate-derived Ets factor，PDEF）是一个ETS转录因子家族成员［1］，位于6p21.3，全长1.86kb，其表达于正常前列腺上皮中［2］，在气道、乳腺、胃、小肠和大肠的上皮细胞中也发现PDEF的表达［3-5］。ETS家族转录因子的表达失调，在一些肿瘤的形成过程中起到了关键性的作用［6-7］。PDEF作为ETS家族转录因子的一员其作用近年来也受到广泛重视。已有报道表明PDEF的表达降低与乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌的侵袭与进展有关［8-10］，但是PDEF在肿瘤形成中的作用仍然是目前争论的话题。目前发现在肠组织，PDEF的表达可以促进分泌性祖细胞向杯状细胞分化［11-13］，因此推断结直肠癌的发生可能与PDEF的调控有关。本实验通过转染 PDEF重组质粒进入HCT116细胞，旨在观察PDEF对HCT116细胞株生物学行为的影响，为进一步研究结直肠癌的发病机理奠定基础。

山西省自然科学基金（20111019）

张毅强，男，汉，博士在读，讲师，研究方向：肿瘤分子生物学，E-mail：zhangyiqiangty＠163.com。