miR-125a/TRAF6调控通路在破骨细胞分化中的 作用研究

杨丽，赵新兰，雷丹丹，廖斌，秦爱平

论著·基础

miR-125a/TRAF6调控通路在破骨细胞分化中的 作用研究

杨丽，赵新兰，雷丹丹，廖斌，秦爱平

目的研究miR-125a在破骨细胞分化过程中的作用及其作用机制，方法单核细胞集落刺激因子(M-CSF)和核因子-κB配体的受体激活剂(RANKL)诱导CD+14PBMCs向破骨细胞分化。生物信息学运算预测miR-125a的靶基因以及结合于miR-125a启动子区域的转录因子。实时定量PCR法检测miR-125a以及其他相关基因的表达。过表达实验和抑制试验用于研究miR-125a在破骨细胞分化中的作用及其与靶基因之间的相互关系。荧光素酶报告基因实验验证miR-125a与其靶基因之间的结合。结果(1)miR-125a表达在CD+14PBMCs前体细胞高表达，随着诱导时间的延续逐渐下降，在诱导第5天开始明显下降并在第15天达到最低值,表明miR-125a的表达在破骨细胞分化过程中呈现明显下降趋势。(2)miR-125a参与调控RANKL和M-CSF诱导的破骨细胞分化,过表达miR-125a明显抑制了TRAP和NFATc1的mRNA表达和CD+14PBMCs向破骨细胞的分化。(3)miR-125a直接作用于靶基因肿瘤坏死因子相关因子6 (TRAF6)，TRAF6是RANKL/RANK/NFATc1信号转导通路的转录因子，过表达miR-125a降低了TRAF6的蛋白表达水平，而TRAF6的mRNA水平无明显改变。结论miR-125a通过作用于新的TRAF6/NFATC1/miR-125a负反馈调控环路在破骨细胞的分化中发挥了重要的调控作用，调控miR-125a的表达可能成为骨代谢疾病新的治疗靶点。

microRNA; 破骨细胞分化; 转录因子；靶基因；负反馈调节

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.2 主要仪器： Nikon 300型自动摄像倒置显微镜(日本Nikon公司生产)，电泳仪、转印仪、紫外交联仪、凝胶成像系统(美国Bio．Rad公司生产)，流式细胞仪(美国Coulter公司)。

1.1.3 主要试剂： 无酚红a-MEM培养液、Trizol、及胎牛血清(FBS)、0.25%胰酶-EDTA、胶原酶(美国Gibico公司生产)，RANKL(美国Invitrogen公司生产)，M-CSF(美国Sigma公司)，TRAP染色试剂盒(美国Sigma公司), 染色质免疫沉淀实验试剂盒(Upstate, Charlottesville, VA), anti-miR-125a(GenePharma Co., Ltd), NFATc1 siRNA(OriGene Technologies Inc)。

1.2 方法

诱导液(25 ng/ml重组人类巨噬细胞集落刺激因子+30 ng/ml RANKL)诱导破骨细胞分化。抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色法鉴定破骨细胞的成熟，同时检测组织蛋白酶免疫染色并检测破骨细胞分化标志性基因，如RAP和活化T细胞核因子磷酸酶依赖因子1的mRNA的表达水平。

1.2.2 实时定量PCR分析： 利用罗氏实时荧光定量PCR仪，方法按参考文献[10]。 miR-125a、U6、TRAF6、NFATc1、TRAP和β-actin的引物见表1、表2， U6和β-actin作为内参。

表1 mRNA实时定量RT-PCR引物序列

表2 mRNA实时定量RT-PCR引物序列

注: F. 正向引物; R.反向引物; Acc. No. Genbank公布的准入号

1.2.3 TRAP染色： 利用TRAP染色试剂盒进行染色。在显微光镜下(× 200)随机挑选10个视野观察TRAP染色阳性的细胞(细胞核≥3)，每个视野计数重复3次，取平均值。

1.2.4 免疫组化: PBMCs的培养方法同前。多聚甲醛固定诱导液下培养于二孔板中的破骨细胞。破骨细胞免疫染色方法按参考文献 [11]。

1.2.5 miR-125a靶基因预测： 目前有大量miRNA靶基因预测软件，其各有特点。TargetScan软件是一个常用的预测软件。在本研究中利用TargetScan预测并使用RNA22-HSA进行验证。

1.2.6 质粒构建与转染： 质粒构建方法按参考文献[12]，构建包含所预测miR-125a结合位点的WT-pGL3-TRAF6-3′UTR。引物如下，F：5′-GGCTCTAGACTAATAGGGAGATGATTT-3′，R：5′-GGCCGGCCGCATTACCAGACAACTTTA-3′。MUT-pGL3-TRAF6-3′UTR. 突变引物如下，F：5′-TATCGTGGAATCTAGTTCTCCG CGAGACCCGCAACTAGTATAAG-3′，R：5′-GCTTATACTAGTTGCGGGTCTCGCGGAGAACTAGATTCCA CGATA-3′miR-125a 特异性抑制剂2′-O-甲基反义寡核苷酸(anti-miR-125a)和脂质体复合体严格按说明书直接和细胞混合。

1.2.7 荧光素酶报告基因实验： 外周血单核细胞与野生型或突变型 pGL3-TRAF6-3′UTR和miR-125a 或 miR-C共培养48 h。空脂质体作为阴性对照。

双荧光素酶报告基因系统(Promega)和光度计用以荧光信号定量。每个荧光素酶值通过海肾荧光素酶值进行校正。

2 结 果

图3 miR-125a抑制破骨细胞分化的标志性基因NFATC1的表达

2.3 miR-125a直接作用于靶基因肿瘤坏死因子相关因子6 (TRAF6) 利用TargetScan软件预测miR-125a的靶基因。在TRAF6的3′UTR区存在miR-125a的碱基互补序列(图4A)。TRAF6是破骨细胞分化中的重要调控因子。

我们检测了调控破骨细胞分化的一些重要基因如c-Fos、Mitf和NF-κB基因在转染pre-miR-125a或miR-C以及anti-miR-125a或anti-C前后的表达情况。结果示，miR-125对c-Fos和Mitf基因的表达没有影响，过表达miR-125a促进NF-κB的蛋白表达，反之则抑制其表达(图4E)。而NF-κB不是miR-125a的靶基因。

注：A.图示标明了在TRAF6的3’UTR端存在有miR-125a的结合位点。并且标注了与miR-125a结合序列结合的野生型(WT)TRAF6- 3’UTR以及突变型(MUT)TRAF6- 3’UTR

B，C.miR-125a在转录后水平抑制TRAF6的表达。过表达或抑制miR-125a的表达可以降低或提高TRAF6的蛋白表达水平而不影响其mRNA表达水平。与对照组比较，aP<0.05

D.荧光素酶报告基因实验示：共转染pre-miR-125a可以降低野生型(WT)TRAF6- 3’UTR的荧光素酶活性而不影响突变型(MUT)TRAF6- 3’UTR的荧光素酶活性。与对照组比较，aP<0.05

E.过表达或下调miR-125a的表达可抑制或升高NF-κB蛋白水平却对破骨细胞分化相关的其他一些关键基因无直接作用

图4 miR-125a直接作用于其靶基因TRAF6

3 讨 论

本研究发现过表达miR-125a抑制了TRAP+多核巨细胞的生成同时也抑制了TRAP 和NFATc1的基因表达。反之则结果相反。表明miR-125a在破骨细胞的分化过程中起到了重要的调控作用。

研究已发现miRNAs通过与靶基因的3’UTR结合来抑制靶基因的转录或降低靶基因mRNA的稳定性。我们利用TargetScan软件预测发现RANKL信号转导因子肿瘤坏死因子相关因子6 (TRAF6)是我们所预测的靶基因之一。结果提示miR-125a通过与TRAF6 mRNA的3’UTR结合来调控破骨细胞的分化。

TRAF6是NF-κB受体活化因子(RANK)的重要的衔接分子，在破骨细胞膜与RANK结合并激发了TRAF6的募集并进一步激活NF- κB和NFATc1促使破骨细胞的形成[15，16]。TRAF6是TRAF超家族和白介素-1/Toll样受体超家族的重要信号转导因子。研究报道TRAF6和RANK的耦联对于破骨细胞的骨吸收功能的维持至关重要。因此，TRAF6在破骨细胞分化和成熟过程中其重要的调控作用[17]。

本研究证实miR-125a通过作用于靶基因TRAF6调控破骨细胞分化。荧光素酶报告基因实验显示过表达miR-125a可抑制野生型TRAF6荧光素酶报告基因活性，而突变型TRAF6荧光素酶报告基因载体可取消该作用。另外，过表达和抑制试验表明miR-125a在转录后水平抑制TRAF6的表达水平。而对其他一些可能对破骨细胞分化起调控作用的基因例如：c-Fos、小眼畸形相关转录因子(Mitf)和NF-κB的表达没有影响。这些结果提示miR-125a在转录后水平抑制TRAF6基因的表达。

本研究数据可以得出miR-125a的作用模式。破骨细胞分化信号在破骨细胞前体细胞激活TRAF6/NFATc1转导通路，miR-125a表达的下降维持了TRAF6的蛋白表达并维持了破骨细胞分化过程。因此，一个新的miR-125a/TRAF6调控通路被挖掘出来。

综上所述，本研究证实了miR-125a通过一个新发现的调控通路参与破骨细胞的分化调节。我们的研究为miRNA在破骨细胞分化中的作用提供了新的认识，揭示了miR-125a在破骨细胞分化过程中的重要作用并使miR-125a表达的调控,可能成为治疗骨代谢疾病的新的手段。

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EffectofmiR-125a/TRAF6/NFATC1loopmediatesonosteoclastogenesis

YANGLi*,ZHAOXinlan,LEIDandan,LIAOBin,QINAiping.

*DepartmentofEndocrinology,HunanProvinceMawangduiGeriatricHospital,Changsha410016,China

QINAiping,E-mail:qinaip@163.com

ObjectiveTo investigate the effect of miR-125a in the process of osteoclast.MethodsMonocyte colony stimulating factor (M-CSF) and nuclear factor kappa B ligand / receptor activator (RANKL) induced CD+14PBMCs to osteoclast. The target gene bioinformatics arithmetic predictive miR-125a and miR-125a binding to initiate transcription factor sub region. To detect the expression of miR-125a using real-time quantitative PCR and other related genes. Overexpression experiments and inhibition test were used to investigate the relationship between effect of miR-125a in osteoclast differentiation and target gene. Used the luciferase reporter gene experiments to verify the combination between miR-125a and its target gene.Results(1) miR-125a expression in CD+14PBMCs precursor cells showed high expression level, with a continuation of the induction time, the expression decreased gradually, and reached the lowest value at fifteenth days, which showed that the expression of miR-125a revealed a clear downward trend in osteoclast differentiation process. (2) miR-125a are involved in the regulation of RANKL and M / CSF induced osteoclast differentiation, over expression of miR-125a significantly inhibited the expression of mRNA and CD+14PBMCs TRAP and NFATc1 to differentiate into osteoclasts. (3) miR-125a direct effect on target gene expression of tumor necrosis factor related factor 6 (TRAF6), TRAF6 is a transcription factor of the RANKL/RANK/NFATc1 signaling pathway, overexpression of miR-125a decreased the protein expression level of TRAF6, but no significant change of TRAF6 mRNA level were found.ConclusionIt proved that the miR-125a played an important role in the regulation of osteoclast differentiation by acting on the new TRAF6/NFATC1/miR-125a negative feedback control loop, expression and

regulation of miR-125a may become a new therapeutic target for metabolic bone diseases.

microRNA; Osteoclast; Transcription factor; Target gene; Negative feedback

湖南省自然科学基金(No.13JJ4119)

410016 长沙，湖南省马王堆医院老年内分泌科(杨丽、赵新兰、廖斌、秦爱平)； 410010 中南大学湘雅二医院 内分泌科(雷丹丹)

秦爱平，E-mail:qinaip@163.com

10.3969 / j.issn.1671-6450.2014.11.019

2014-08-12)