脐血干细胞移植对失代偿期肝硬化肝功能及血流动力学的影响

王可敬，罗晓红，孙厚坦，王方，包建涛

论著·临床

脐血干细胞移植对失代偿期肝硬化肝功能及血流动力学的影响

王可敬，罗晓红，孙厚坦，王方，包建涛

目的观察脐血干细胞移植治疗失代偿期肝硬化的疗效及对肝血流动力学的影响。方法选择失代偿期肝硬化患者30例为治疗组，经肝固有动脉进行异体人脐血干细胞移植；选择资料匹配的同期住院未行脐血干细胞输注的失代偿期肝硬化患者20例作为对照组。比较2组患者肝功能、凝血功能、门静脉血流动力学、B型超声肝脏体积及造影剂消退时间等指标，并观察患者临床症状改善情况及不良反应。结果治疗组肝内脐血干细胞移植成功率为100%，无不良反应和并发症发生。与治疗前比较，2组治疗后3、6个月谷氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、白蛋白(Alb)均有改善(P<0.05)，且治疗组Alb改善优于对照组(P<0.05)；与治疗前比较，治疗组治疗3、6个月总胆红素(TBil)明显降低，对照组治疗6个月时降低(P<0.05)；治疗组治疗1、3、6个月后甲胎蛋白(AFP)明显增加，且与对照组同时点比较差异有统计学意义(P<0.05)。与移植前比较，治疗组凝血酶原时间(PT)于移植后3 、6个月显著下降(P<0.05)，与对照组比较差异显著(P<0.05)；纤维蛋白原(Fib)在移植后3、6个月显著增加(P<0.05)，与对照组比较差异不显著(P>0.05)。凝血活酶时间(APTT)和凝血时间(TT)在移植后均呈降低趋势，但与移植前差异不显著，对照组亦无明显变化(P>0.05)。与治疗前比较，2组门静脉内径(DPV)、脾静脉内径(DSV)、门静脉最大流速(PVX)、脾静脉最大流速(SVV)、门静脉血流量(QPV)、脾静脉血流量(QSV)差异均无统计学意义(P>0.05)。治疗后，2组肝脏体积均有增大趋势，但比较差异均无统计学意义(P>0.05) 。与治疗前比较，脐血干细胞移植后，治疗组造影剂消退时间明显减慢(P<0.05)，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论经肝固有动脉行脐血干细胞移植治疗失代偿期肝硬化可以改善肝功能及静脉血流情况，且安全有效，为临床肝病的治疗探索了新途径。

脐血干细胞；肝硬化；失代偿期；血流动力学

近年来，随着干细胞研究的不断深入，采用干细胞治疗终末期肝病显示出良好的应用前景。Yang等[1]研究证实，脐带血干细胞可分化为肝细胞，使脐血干细胞移植治疗肝脏疾病成为可能。研究表明，与外周血及骨髓干细胞相比，脐带血干细胞移植比例更高、自我繁殖能力强更、繁殖速度更快[2]。现将脐带血干细胞经肝固有动脉移植于失代偿期肝硬化患者，观察脐血干细胞治疗的疗效及对肝静脉血流动力学的影响，报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 2012年2月—2013年4月我院住院的失代偿期肝硬化并行脐血干细胞治疗患者30例为治疗组，选取同期住院未行脐血干细胞治疗的失代偿期肝硬化患者20例为对照组。所有病例均符合失代偿期肝硬化诊断标准。治疗组男21例，女9例；年龄42～70岁，中位数53岁；乙型肝炎后肝硬化20例，酒精性肝硬化4例，丙型肝炎后肝硬化3例，胆汁性肝硬化3例；肝功能Child分级：B级10例，C级20例。对照组男14例，女6例，年龄41～70岁，中位数52岁；乙型肝炎后肝硬化15例，酒精性肝硬化2例，丙型肝炎后肝硬化2例，胆汁性肝硬化1例；肝功能Child分级：B级6例，C级14例。2组患者性别、年龄、肝功能分级、肝硬化类型等一般资料比较，差异无统计学意义(P﹥0.05)，具有可比性。所有患者均知情同意并签署知情同意书，且治疗组签订《脐血干细胞移植治疗同意书》，治疗方案经医院伦理委员会批准。

1.2 脐血干细胞采集 选择本院收治的健康产妇，排除乙型肝炎、丙型肝炎、艾滋病、梅毒及其他传染病，无病理妊娠。胎儿娩出并断脐后，常规消毒采血部位，以封闭式采血法采血并装入有ACD-B保存液的一次性采血袋，每袋采脐血约80～160 ml备用。用负收集法分离提取脐带血干细胞，试剂盒由宁夏中联达生物有限公司提供。在严格无菌条件下，按照操作步骤进行分离提取，每例提取的脐带血干细胞总数要高于(1.6～7.3)×109，将分离好的细胞用5 ml生理盐水稀释，立即进行干细胞移植。

1.3 治疗方法 对照组20例病毒性肝炎后肝硬化患者依据我国慢乙肝防治指南，失代偿期乙型肝炎肝硬化给予口服抗病毒、保肝等治疗，失代偿期丙型肝炎后肝硬化、酒精性肝硬化、胆汁性肝硬化的病例常规给予保肝、改善肝脏微循环及对症等治疗。治疗组在放射介入条件下，经股动脉穿刺插管至肝固有动脉，选择性肝固有动脉造影排除肝癌后，将制备好的脐血干细胞悬液按脉冲方式经肝固有动脉输入，术后穿刺点常规加压、包扎，患者穿刺肢制动24 h。术后常规静脉滴注促肝细胞生长素1周。

1.4 观测指标 于术前造影观察造影剂消退时间，术后3、6个月再次造影评估造影剂消退时间。

1.4.1 肝功能和凝血功能测定： 各组患者于手术当天和术后1周、1个月、3个月、6个月之日晨起空腹取肘静脉血5 ml，所有血样均用30 μl 10% EDTA和40 μl抑肽酶抗凝，静止30 min后4℃离心，收集血清保存于-80℃待测。肝功能指标采用日立7080型全自动生化分析仪测定，包括谷氨酸氨基转移酶(ALT)、白蛋白(Alb)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、总胆红素(TBil)和甲胎蛋白(AFP)水平，试剂盒购于上海生物仪器有限公司。凝血指标采用日本SYSMEX血凝仪(CA-50)检测，包括凝血酶原时间(PT)、纤维蛋白原(Fib)、活化部分凝血活酶时间(APTT)和凝血时间(TT)，试剂盒购于上海太阳生物技术有限公司。以上检测严格按照试剂盒说明书进行操作，同一阶段标本均在同一批测定中完成。

表1 2组肝硬化患者肝功能各指标的变化情况

注：与治疗前比较，aP<0.05;与对照组治疗后同时点比较，bP<0.05

1.4.2 血流动力学参数测定： 使用Siemens Acuson Sequoia 512型彩色多普勒超声诊断仪探测门静脉(PV)、脾静脉(SV)，取样长度2 cm，测出血管左右径(A)和前后径(B)，计算血管截断面积(S)，公式为：S=(A×B×π)/4。血流速度(V)则以流速方向为主轴，相当于血管中心部超声所测得流速微血管最大流速Vmax。血流量参数(Q)计算公式为：Q=S×(0.57×Vmax)/COS×60(ml/min)，同一患者每次受检时取样线与血流夹角保持相同，于平静呼吸吸气位屏气时分别检测脾静脉内径(DSV)、脾静脉流速(SVV)、脾静脉血流量(QSV)，取3个心动周期的平均值为观察值。

1.4.3 肝脏体积测定： 使用Siemens Sensation 16层螺旋CT机，常规CT平扫全肝，图像选用Wizard工作站的Volume软件处理，自动快速获取肝脏体积。

1.4.4 造影剂消退时间观察： 使用Siemens Acuson Sequoia 512型彩色多普勒超声诊断仪，造影剂为SonoVue(意大利BRacco公司)，使用前用5 ml 0.9%氯化钠溶液溶解，混匀后吸取2.4 ml快速注入肘静脉，立即开始实时记录造影剂的消退时间。

2 结 果

2.1 脐血干细胞移植成功率及不良反应 治疗组30例患者肝内脐血干细胞移植成功率100%，未见发热、白细胞降低，穿刺部位无出血及渗出，未见肝区疼痛者。术后未发生与移植相关的不良反应和并发症。

2.2 肝功能变化 与治疗前比较，2组治疗后3、6个月ALT、AST均改善(P<0.05)，2组比较差异不显著(P>0.05)；与治疗前比较，治疗组治疗后3、6个月2组Alb均明显升高(P<0.05)，且治疗组优于对照组(P<0.05)。与治疗前比较，治疗组3、6个月TBil显著降低(P<0.05)，对照组治疗6个月下降(P<0.05)。与治疗前比较，治疗组治疗后1、3、6个月AFP明显增加 (P<0.05)，与对照组比较差异有显著意义(P>0.05)。见表1。

2.3 凝血功能变化 与治疗前比较，治疗组PT于治疗后3、6个月显著下降(P<0.05)，与对照组比较差异显著(P<0.05)；Fib在治疗后逐步增加至正常，在治疗后3、6个月显著增加(P<0.05)，与对照组比较差异不显著(P>0.05)。APTT和TT在治疗后均呈降低趋势，但与治疗前比较差异不显著(P>0.05)，与对照组比较差异亦不显著(P>0.05)。对照组除治疗后6个月PT、Fib改善外，余指标均无明显变化(P>0.05)。见表2。

2.4 门静脉系统血流动力学变化 与治疗前比较，肝细胞移植6个月后，治疗组门静脉内径(DPV)和DSV均有一定程度下降，但差异不显著(P>0.05)，与对照组比较，差异亦不显著(P>0.05)。门静脉最大流速(PVX)、SVV在移植后呈增快趋势，但与治疗前比较差异不显著(P>0.05)，与对照组比较差异亦不显著(P>0.05)。此外，治疗后QSV、门静脉血流量(QPV)也呈下降趋势，与治疗前和同期对照组比较差异不显著(P>0.05)。见表3。

表2 2组肝硬化患者凝血功能各指标的变化情况

注：与治疗前比较，aP<0.05;与对照组治疗后同时点比较，bP<0.05

表3 2组肝硬化患者门静脉系统血流动力学参数变化

表4 2组肝硬化患者治疗前后肝脏体积变化

2.5 肝脏体积测定 治疗后，治疗组、对照组肝脏体积均有增大趋势，但与治疗前比较差异均无统计学意义(P>0.05) 。见表4。

2.6 造影剂消退时间 与治疗前比较，脐血干细胞移植后，治疗组造影剂消退时间明显减慢(P<0.05)，与对照组比较差异显著(P<0.05)。见表5。

表5 2组肝硬化患者治疗前后造影剂消退时间变化情况

注：与治疗前比较，aP<0.05；与对照组治疗后同时点比较，bP<0.05

3 讨 论

我国约有3 000多万慢性乙型肝炎患者，其中约20%发展为肝硬化，仅失代偿期肝硬化患者就多达630余万人，每年病死率为20%～50%，且呈逐年上升趋势[3]。如何改善失代偿期肝硬化患者肝功能是临床研究的难点和热点，近年来，现代外科手术和移植相关技术发展迅猛，使肝脏移植成为治疗失代偿期肝硬化的重要手段，但三大“瓶颈”也制约了这项技术的广泛开展和应用：(1)肝脏供体长期缺乏，以2010年为例，潜在适合肝移植患者中，仅有2 144例患者接受肝移植治疗[4]，每年有大量的患者在等待器官移植中死亡。(2)免疫排斥反应大，是导致肝移植后死亡的最主要原因；其次，肝移植后患者需终身服用免疫抑制剂，可导致机体免疫功能低下、肝肾功能受损、继发感染等。(3)器官移植医疗费用高，普通家庭难以承担，也是导致肝脏移植无法广泛开展的重要原因之一。

近年来，随着干细胞技术和再生医学的发展，大量的资料表明干细胞移植治疗肝脏疾病是有效的，为失代偿期肝硬化提供新的前景[5～8]。干细胞是人体内最原始的未分化细胞，具有自我复制功能及多分化潜力，在一定条件下可以分化为多种功能细胞。Beerheide等[9]将干细胞用荧光染色后移植到小鼠的肝脏内，移植后1周发现这些干细胞已整合到小鼠的肝脏组织里面，并检出了人源性的白蛋白。大量研究表明，在肝损伤及肝细胞再生过程中，干细胞起着重要的作用，将干细胞移植到肝病患者肝内，可使其在肝脏中分化为具有功能的肝实质细胞，使损伤的肝功能恢复和重构[10，11]。干细胞可以分为胚胎干细胞、脐血干细胞和成人干细胞，成人干细胞主要包括骨髓干细胞、外周血干细胞及神经干细胞等，其中用于肝硬化移植研究的主要为骨髓干细胞。胚胎干细胞具有极强的可塑性和增殖能力，但存在伦理上的分歧、异体抗原、无限增殖的潜力和导致恶性肿瘤的发生等诸多问题。自体骨髓干细胞是一种很好的移植干细胞，赵和平等[12]利用骨髓干细胞治疗肝硬化也取得了一定的疗效，但细胞数量及质量一直是影响其治疗效果的关键因素。自体骨髓干细胞治疗需要采集自体骨髓，患者需承担骨髓穿刺风险及穿刺痛苦，且采集骨髓干细胞的质量还受年龄限制，这些因素在一定程度上制约了自体骨髓干细胞治疗的发展。

脐血单个核细胞来源于新生儿脐血，其来源广泛、免疫原性低、提纯效果好、移植排斥发生率低，且不受伦理道德限制，是近年来国内外的研究热点[13]。研究发现脐血中可移植干细胞比例明显高于成人骨髓及外周血，且与骨髓干细胞相比自我繁殖能力更强、速度更快。脐血干细胞具有横向分化能力，实验证明在一定条件下，脐血干细胞可被诱导分化为脂肪细胞、肌细胞、心肌细胞、软骨细胞、骨细胞、神经细胞及肝细胞等[3]。Doan等[14]实验发现脐血干细胞培养在肝细胞微环境下可以检测到这些细胞能表达肝细胞表面标志如Alb、CK18、Thy-I、c-kit等，并通过对比得出脐血来源的间充质干细胞比骨髓来源的干细胞更具有临床及实用价值。

Zhang等[15]研究显示，与注射生理盐水对照组相比较，利用脐血干细胞治疗失代偿期肝硬化，可明显改善患者肝功能，提高患者生活质量。

肝脏是人体合成和代谢的主要场所，ALT、AST、Alb、TBil、AFP等指标是反映肝脏合成和代谢能力的主要指标。本结果显示，脐血干细胞移植后患者的肝功能明显改善，脐血干细胞移植对失偿期肝硬化的治疗明显优于其他治疗方法；并且改善了患者凝血功能；在一定程度降低了门静脉阻力；但肝脏均有一定程度增大，且增大程度大于对照组，但差异无统计学意义；结合肝脏体积与血流动力学参数来看，肝脏体积的增大并未增加门静脉高压。综合各指标比较后发现，干细胞移植后，移植组的治疗效果显著优于对照组，且移植后患者并未出现与移植相关的严重不良反应和并发症，这些都表明个体化干细胞移植治疗失代偿期肝硬化是可行的。

随着肝硬化发病机制和干细胞治疗相关研究的不断深入，大量临床数据证实干细胞在修复受损肝细胞、恢复肝功能及治疗肝功能衰竭方面具有重要意义。但临床上，干细胞的移植途径、最佳移植时间和疗程次数等还需进一步探讨和研究。

综上所述，本研究对脐血干细胞移植治疗失代偿期肝硬化的疗效和肝血流动力学进行了细致的分析总结，试验结果初步显示经肝固有动脉行脐血干细胞移植能改善肝脏合成功能，促进肝组织再生，改变门静脉血流动力学并促进新血管重建，提示肝固有动脉输注脐血干细胞治疗失代偿期肝硬化安全、简单、有效，为临床肝病治疗探索了新的途径。

1 Yang WZ,Zhang Y,Wu F,et al.Human umbilical cord blood-derived mononuclear cell transplantation：case series of 30 subjects with hereditary ataxia[J].J Transl Med,2011,(9):65.

2 Atsuta Y, Morishima Y, Suzuki R, et al. Comparison of unrelated cord blood transplantation and HLA-mismatched unrelated bone marrow transplantation for adults with leukemia[J]. Biology of Blood and Marrow Transplantation, 2012, 18(5): 780-787.

3 徐玉琴, 石文明, 李金顺,等. 脐血单个核细胞移植治疗失代偿期肝硬化[J]. 中国组织工程研究， 2013, 17 (45): 7975-7980.

4 中国肝移植注册.2010年中国肝移植概况[J/CD]. 中华移植杂志:电子版,2011，5(4):270.

5 Harris DT.Non-haematological uses of cord blood stem cells[J]. British J Haematol，2009, 147 (2): 177-184.

6 Zhao Q, Ren H, Zhu D, et al. Stem/progenitor cells in liver injury repair and regeneration[J]. Biol Cell， 2009, 101 (10): 557-571.

7 张丽欣，邢利和，张丽丽，等.脐血干细胞移植治疗失代偿期肝硬化的临床效果研究[J].中国全科医学，2010，13(24)：2680-2682.

8 杨华强，李红，李玉玲.脐血干细胞移植治疗缺血性心脏病的临床研究[J].疑难病杂志，2014，13(4):361-364.

9 Beerheide W, Von Mach M, Ringel M, et al. Downregulation of Β2-microglobulin in human cord blood somatic stem cells after transplantation into livers of scid-mice:an escape mechanism of stem cells[J].Biochem Biophys Res Commun，2002, 294 (5): 1052-1063.

10 Russo FP,Parola M. Stem cells in liver failure[J]. Best Practice & Research Clinical Gastroenterology, 2012, 26(1): 35-45.

11 Huch M, Boj SF,Clevers H. Lgr5+ liver stem cells, hepatic organoids and regenerative medicine[J]. Regen Med,2013, 8(4): 385-387.

12 赵和平, 丁保华, 邵丹,等. 自体骨髓干细胞移植治疗失代偿期肝硬化患者的疗效观察[J]. 实用肝脏病杂志， 2012, 14 (6): 424-426.

13 Lee MW,Jang IK,Yoo KH,et al.Stem and Progenitor Cells in Human Umbilical Cord Blood[J]. In J hematol，2010, 92 (1): 45-51.

14 Doan CC,Le TL,Hoang NS,et al.Differentiation of human umbilical cord lining membrane-derived mesenchymal stem cells into hepatocyte-like cells[J]. ISRN Stem Cells, 2013, 2013.

15 Zhang Z, Lin H, Shi M, et al. Human umbilical cord mesenchymal stem cells improve liver function and ascites in decompensated liver cirrhosis patients[J].J Gastroenterol Hepatol，2012, 27 (s2): 112-120.

Effectoflivervolumeandliverhemodynamicsofhumanumbilicalcordbloodstemcelltransplantationondecompensatedcirrhosis

WANGKejing,LUOXiaohong,SUNHoutan,WANGFang,BAOJiantao.

DepartmentofEndocrinology，LanzhouMilitaryRegionGeneralHospital,Lanzhou730030,China

ObjectiveTo observe the therapeutic effect of umbilical cord blood stem cells transplantation in the treatment of decompensated cirrhosis of the liver and the effects on liver hemodynamics.Methods30 cases of patients with decompensated liver cirrhosis as treatment group, underwent the proper hepatic artery allogeneic umbilical cord blood stem cell transplantation; chosen the data matched 20 cases of patients with decompensated cirrhosis who did not receive the injection of umbilical cord blood stem cells treatment as the control group. Liver function, coagulation function, hemodynamics of portal vein, B ultrasound contrast agent was compared between the 2 groups of patients. The time of the liver volume and other indicators, the clinical symptoms and adverse reaction were observed.ResultsThe success rate of intrahepatic umbilical cord blood stem cell transplantation was 100% in the treatment group, no adverse reaction and complication were occurred. Compared with before treatment, after the treatment in the 2 groups, 3, 6 months of glutamate aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST), albumin (Alb) were improved (P<0.05), and the Alb in the treatment group was better than the control group (P<0.05); and compared with before treatment, in the treatment group, 3, 6 months of total bilirubin (TBil) decreased significantly, control group reduces at 6 months after treatment (P<0.05); in treatment group, 1, 3, 6 months later, AFP significantly increased, compared with the control group at the same time, the difference was statistically significant(P<0.05).Compared with the treatment group before transplantation,prothrombin time(PT)after transplantation in 3, 6 months was significantly decreased (P<0.05), the difference was significant compared with control group (P<0.05); fibrinogen (Fib) in 3, 6 months after transplantation was significantly increased (P<0.05), compared with the control group, the difference was not significant (P>0.05). Thromboplastin time (APTT) and prothrombin time (TT) after transplantation showed a decreasing trend, but with no significant difference before transplantation, the control group had no significant changes (P>0.05). Compared with before treatment, 2 groups of portal vein diameter (DPV), splenic vein (DSV), portal vein flow velocity (PVX), splenic vein (SVV), portal venous blood flow (QPV), splenic vein blood flow (QSV) did not show statistically significant differences (P>0.05). After treatment, 2 groups of liver volume were showing increasing trend, but no significant difference were found (P>0.05). Compared with before treatment, umbilical cord blood stem cell transplantation, the treatment group contrast agent subsided significantly slow down (P<0.05), compared with the control group, a statistically significant difference were found (P<0.05).ConclusionThe proper hepatic artery umbilical cord blood stem cell transplantation in the treatment of decompensated cirrhosis can improve liver function and blood flow, is a new approach for the treatment of liver diseases.

Umbilical cord blood stem cells; Liver cirrhosis; Decompensation; Hemodynamics

甘肃省自然科学基金项目(No.1208RJZA062)

730070 兰州军区总医院内分泌科

10.3969 / j.issn.1671-6450.2014.11.008

2014-05-17)