多发性骨髓瘤免疫表型及胞浆轻链检测的临床意义

朱 杰，赵成艳，王 敏，高艳飞，常青燕

（1.大连医科大学第二临床学院 检验科，辽宁 大连116027；2.辽河油田第二医院 检验科，辽宁 盘锦124000；3.大连市第六人民医院 药剂科，辽宁 大连116021）

多发性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是以克隆性恶性浆细胞（骨髓瘤细胞）在骨髓中异常增殖，并伴有单克隆免疫球蛋白（monoclonal immunoglobulin）增多为特征的疾病［1］，其发病机制尚不清楚。特点是单克隆的浆细胞在骨髓中异常增殖（可达骨髓内细胞总数的90%），破坏骨髓造血功能并分泌单克隆免疫球蛋白或或其多肽链亚单位（如轻链，light chain，L），并通过多种机制产生临床症状及体征。多发性骨髓瘤多发于中老年人，临床表现多种多样，主要表现为骨髓瘤细胞增生、浸润和破坏骨组织及髓外其他组织，出现骨痛、病理性骨折、贫血、出血，以及骨髓瘤细胞产生大量单克隆免疫球蛋白而出现感染、高钙血症、肾脏病变、高粘滞血症、淀粉样变等，尤其在疾病早期，表现无特异性，极易漏诊和误诊，延误治疗、错误治疗增加患者痛苦。国内一般通过三色流式细胞术来对MM患者的骨髓细胞进行免疫表型特点的研究，而本实验是通过四色流式细胞术对其进行免疫表型分析，以期望为MM的诊断提供高可靠的依据和方法。

1 材料与方法

1.1 研究对象

样本来源：2011年1月至2011年12月大连医科大学附属第二医院住院MM患者45例，其中女性12例，男性33例，中位年龄60岁；均为初诊患者，骨髓细胞学检查瘤细胞占（15－95%），其中分泌型为37例（IgG型为27例，IgA型为10例）轻链型为5例（λ链型4例，κ链型1例），不分泌型3例。

1.2 仪器

流式细胞仪：FACSCalibur美国BD公司。

1.3 试剂

CD38－FITC／CD56－PE／CD19－Percp、 CD138－PE、CD45－APC、κ－FITC／λ－PE／ CD19－Percp、κ－FITC／λ－PE、IgG2a－FITC、IgG1－PE，溶 血 素、破 膜剂，以上试剂均购自美国BD公司。

1.4 标本的采集

无菌操作抽取0.2ml骨髓液涂片作显微镜形态学检查。另抽取2ml置于EDTA－K2抗凝血常规管作免疫分型，6h内完成检验。

1.5 标本的处理

骨髓涂片行瑞氏－吉姆萨染色，显微镜下观察并分类计数200个有核细胞。抗凝的骨髓液l ml，加3 ml PBS液，混匀后，在水平离心机上离心（1 500r／min，5min），弃去上清液，加1ml PBS液，计数白细胞数，调节至5×106／ml，制成细胞悬液备用。

1.6 实验方法

1.6.1 胞膜的标记及胞浆内轻链的标记

（1）胞膜的标记：每管100μl细胞悬液分别加入 （IgG2a－FITC、IgG1－PE、CD45－APC）、（CD38－FITC ／CD56－PE／CD19－Percp、 CD45－APC ）、（CD138－PE、CD45－APC）、（κ－FITC／λ－PE／ CD19－Percp、CD45－APC）各20μl，混匀避光15min，加配置好的溶血素2ml，避光10min，在水平离心机上离心（1 500r／min，5min），弃去上清液，加1ml PBS液，混匀备用。

（2）胞浆内轻链的标记：取两只试管，每管100 μl细胞悬液分别加入 CD45－APC 20μl，避光15 min，再加入破膜剂A液100μl，避光10min，加溶血素2ml，避光10min，在水平离心机上离心（1 500 r／min，5min），弃去上清液，加入溶血素B液50μl，分 别 加 入 （IgG2a－FITC、IgG1－PE）、（κ－FITC／λ－PE），避光15min，加2ml PBS洗涤，在水平离心机上离心（1 500r／min，5min），弃去上清液，加1ml PBS液，混匀备用。

1.6.2 流式细胞仪测定

用荧光微球校准仪器及补偿后，用Cellquset软件收取10000个细胞，通过CD45／SSC和CD38／CD56联合设门，确定瘤细胞的位置及抗原表达情况。

1.7 数据分析

每个抗体阳性率＞20%为阳性，反之阴性。

2 结果

2.1 免疫表型的检测结果

每例标本先在CD38／CD56图中确定瘤细胞（CD38＋CD56＋或 CD38＋CD56－细胞群），然后在CD45／SSC图中标记其瘤细胞位置，并根据此圈定瘤细胞群并设门，为以后的各图分析做好准备，其瘤细胞比率占10.56%－75.45%，平均35.23%。见图1和图2、图3和图4。

图1 中R1群为CD38＋CD56＋细胞群，在图2中（CD45／SSC）表现为R3的位置为CD45－。图3R1群为CD38＋CD56－细胞群，在CD45／SSC图4中表现为R3的位置为CD45－。

2.2 多发性骨髓瘤瘤细胞免疫表型及胞浆轻链表达 见表1。

其中轻链型胞浆内轻链的表达类型与血清蛋白电泳表达的完全一致。

表1 多发性骨髓瘤细胞免疫表型及胞浆轻链的表达

3 讨论

关于瘤细胞的比率的问题，在骨髓片中的人工计数和流式细胞仪的计数中，由于留给做流式细胞术的骨髓液中常常混血的程度大于骨髓细胞学的人工计数的骨髓片，而且程度不一，所以无法比较二者的关系。

临床上，诊断多发性骨髓瘤（MM）一般根据骨髓细胞学和应用免疫学方法分析检测血和尿的异常M蛋白及轻链。然而，有时形态学偏成熟的骨髓瘤细胞与正常的浆细胞在形态上难以区分。而采用免疫分型法对MM进行分析，是使之有效的方法。文献 报 道［2，3］正 常 的 浆 细 胞 表 达 CD38＋、CD19＋、CD138＋、CD56－。我们对45例MM 患者的检测结果表明：典型的骨髓瘤细胞免疫表型为CD45－／±、CD38＋、CD56＋／－、CD138＋、cκ＋／－或 cλ＋／－、CD56＋／－，而CD19－。

Van Camp等［4］报道多数 （43／55，78%）MM患者有CD56＋表达，而正常浆细胞没有CD56的表达。因此，有的人认为CD56是区分正常与恶性浆细胞的重要标志之一［5］。我们检测的结果与Van Camp的相似，但CD56＋的细胞占（87%，39／45），比报道高。因此提示，虽然CD56是区分正常与恶性浆细胞的重要标志，CD56阳性有助于MM 的诊断，但CD56阴性不能除外MM的诊断，还应该结合其它特性进行综合分析，这与黄春妮等人［6］的观点一致。

CD19是包括正常浆细胞在内的B细胞系的一个重要标志，但在我们检测的45例MM标本中，无一例细胞具有 CD19＋表征，Adam［7］，Harada［8］，Ely SA［9］也表明CD19在MM中几乎不表达。因此，应用多参数流式细胞术，根据特定细胞群CD56和CD19表型可以明确MM骨髓中瘤细胞的负荷量。本文中6例CD56MM中，3例为轻链型，3例为不分泌型，并且临床表现较一致，均是外周血三系减少的病例，那么CD56－是否与疾病的不良过程有关，因本文的病例较少，需要长期的临床观察。

CD38：研究表明CD38是NAD糖基水解酶，与细胞增殖和激活有关。在人的正常骨髓中，无论是髓系或B淋巴系前体细胞以及成熟的淋巴细胞、单核细胞、粒细胞，CD38均有不同程度的表达，但仅在浆细胞表面可被检测到超强表达，被认为是特异性的浆细胞表面标志［10］。CD38与多发性骨髓瘤的瘤细胞关系最为密切，常被用作骨髓瘤细胞的鉴定指标，一般认为，CD38在稳定期仍高表达，表明稳定期中虽然患者的临床症状有所改善，骨髓中浆细胞比例恢复正常，但肿瘤克隆细胞仍没有被完全清除［11］。

CD45：即白细胞分化抗原，是单链跨膜糖蛋白，属于蛋白酪氨酸磷酸酶家族的成员，它广泛地存在于除了成熟红细胞和血小板之外所有的造血系细胞表面，在淋巴细胞的发育激活中起重要作用。其广泛表达于浆细胞表面，而在MM细胞中呈阴性或弱阳性表达。CD45是近期骨髓瘤免疫表型研究的一个新的热点，CD45设门常被应用到MM的流式免疫分型中，但近年来发现［12］有相当比例的MM病人可监测到CD45高强度表达，而几乎所有的MM患者均含有一小群有增殖活性的浆细胞，此类细胞的表型特点为CD45强阳性，因此目前多结合CD138或CD38等其他表型抗原设门来提高流式免疫分型检测的精确性。

CD138：Syndecan－1分子，属于黏附分子跨膜硫酸乙酰肝素蛋白聚糖家族成员，其表达具有细胞类型和发育阶段的特异性，它们可以参与细胞增殖、细胞黏附等多种功能，并与肿瘤细胞的归巢及转移等过程有关。CD138特异的表达于浆细胞，许多学者如河南郑州的张琦［13］认为几乎所有的MM患者均表达CD138，且不会在骨髓造血前体细胞和淋巴细胞上表达，因此，被认为是骨髓瘤细胞最特异的表面标志，丁润生等人［14］曾报道多发性骨髓瘤的浆细胞主要表达CD138，并证明多发性骨髓瘤细胞CD138表达水平高于正常浆细胞，认为CD138阳性细胞即为骨髓瘤细胞。Garcia［15］，秦燕［10］等曾证实 MM 患者骨髓瘤细胞CD138阳性率几乎达到100%。这些都证实了CD138为MM细胞最特异的表面标志。

本文中所有的 MM 中，全部表达CD138，但CD38、CD138表达并不特异，良性浆细胞亦有表达，故CD38、CD138可以作为骨髓瘤筛选和纯化标志。由于CD138在骨髓瘤细胞的广泛表达，是抗骨髓瘤靶向治疗的理想的作用位点。可以认同以往的学者的观点，即针对CD138抗原的单抗是一个有效的抗骨髓瘤的药物。

检测胞浆轻链判断骨髓瘤细胞的克隆性具有高度的可靠性，张琦［13］认为一个B淋巴细胞克隆在其一生中仅仅产生两型轻链中的一型，我们称其为轻链的同型排斥，鉴于其克隆的独特性，轻链的表达可以作为B系肿瘤的克隆增殖标志，因此如果所有B细胞的损害表现为轻链的单一表达，该肿瘤就很可能是单克隆的，相反的，如果两种轻链数目接近于相等，则可能为多克隆的。胞浆轻链的检测对于某些特殊类型的骨髓瘤的诊断是必须的，轻链型骨髓瘤细胞只分泌一种轻链，由于轻链的分子量很小，血清中检测不到，因此胞浆轻链的检测对确诊起到不可忽视的作用，它也可用于意义未明的单株免疫球蛋白血症，反应性浆细胞增多症（monoelonal grammapathy of undetermined significance，MGUS）、重链病等的鉴别诊断。本文中3例骨髓细胞学找到典型的骨髓瘤细胞，但临床检查中免疫球蛋白及轻链检测均是阴性，胞浆中轻链的检测均阳性，给临床确诊和治疗带来了极大的便利。

本实验利用BD公司最新的荧光免疫表型抗体及破膜剂进行胞膜抗原标记及胞浆内染色，其阳性率令人满意，所有的45例患者均检测到相对应的胞浆轻链，而且与轻链检测相对应（除不分泌型外）。为临床的诊断提供了极大的帮助。

总之，利用四色流式细胞术进行CD45／SSC、CD38／CD56来标记骨髓瘤细胞，并进行 CD19、CD138、胞浆内轻链的检测，可准确地识别骨髓瘤细胞，有助于MM的诊断及治疗疗效的监测。

［1］李金兰，刘艳荣，常 艳，等.多发性骨髓瘤细胞的免疫表型特点［J］.中国实验血液杂志，2002，10（3）：226.

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［5］Gonzalez M，San Migue1JF，Gascon A，et al.Increase expression of natural－killer－associated and activation antigens in multiple myeloma［J］.Am J Hematol，1992，39：84.

［6］黄春妮，李 山，秦 雪.流式细胞术测定多发性骨髓瘤细胞表面标记的研究［J］.广西医学，2007，29（7）：953.

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［8］Harada H，Kawano MM，Huang N，et al.Phenotypic difference of normal plasma cells from mature myeloma cells［J］.Blood，1993，81：2658.

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