三磷酸腺苷发光法快速鉴定非结核分枝杆菌技术的研究

刘 君，裴 豪＊，徐志勤，徐 兰

（1.无锡市第五人民医院 检验科，江苏 无锡214005；2.无锡市海规生物科技有限公司，江苏 无锡214000）

分枝杆菌属内除了结核分枝杆菌复合群和麻风分枝杆菌外统称为非结核分枝杆菌（NTM）。从AIDS开始流行后，非结核分枝杆菌感染才突然得到重视［1］，但是NTM发现的报道主要来源并非是结核高负担的国家和地区，一些真正结核病流行的国家报道则很少见［2－4］。导致这一现象的主要原因在于结核病流行地区大多缺少鉴定非结核分枝杆菌的设备和技术，并且其他疾病对国家财政的压力更大［1］。三磷酸腺苷发光法是通过裂解细菌并释放活菌中的ATP，加入荧光素酶使之发光以判断细菌活力的一种新型检测方法，已在食品安全、微生物等方面广泛应用［5］。本研究是利用三磷酸腺苷发光法检测的原理来实现NTM的快速鉴定，以达到NTM的早期发现和减少漏检。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验菌株：H37Rv（标准人型分枝杆菌）、堪萨斯分枝杆菌来源于江苏省疾病控制中心。55例分离培养菌株来自无锡市第五人民医院2012年1－6月收治入院的患者痰标本。

1.1.2 仪器和试剂：测定三磷酸腺苷发光法所用HygienaPI－102仪器、裂解液及荧光素酶和ATP发光检测管由无锡市海规生物科技有限公司提供。LJ PNB法菌型鉴定培养管购自珠海贝索生物技术有限公司。Airstream R AⅡ型二级生物安全柜购自新加坡ESCO公司。XW－80旋涡混合器购自上海医科大学仪器厂。LRHS－250－Ⅱ恒温恒湿培养箱购自上海跃进医疗器械有限公司。PNB购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 菌悬液的制备：用接种环刮取适量L－J培养基斜面对数生长期的菌落于无菌磨菌瓶，加入1－2滴0.5%吐温－80溶液和适量玻璃珠，用旋涡混合器振荡然后加入0.85%NaCl制备成菌悬液，静止约10min，待大颗粒菌团沉降后取上清液，用比浊仪调至1McF菌悬液。用无菌生理盐水将1McF菌悬液稀释为1∶100的菌液浓度备用。

1.2.2 PNB溶液的制备：称取PNB粉250mg放入小型锥形瓶，加入4%氢氧化钠1.5ml置37℃溶解，用柠檬酸调pH6.5－7.0后再加入无菌蒸馏水至25ml，应用液浓度为10mg／ml备用。

1.2.3 L－J PNB法菌型鉴定实验操作：按照《临床技术操作规范结核病分册》操作［6］。

1.2.4 三磷酸腺苷发光法菌型鉴定实验操作：在培养管中加入一定浓度的PNB溶液、培养液和1∶100稀释的菌悬液0.5ml，生长对照管加入培养液和1∶100稀释的菌悬液0.5ml。分别从鉴定管和生长对照管中取100μl溶液加入裂解液及荧光素酶，用HygienaPI－102检测初始ATP读数，将培养管放入恒温恒湿培养箱培养并检测其3、5和7天时鉴定管和生长对照管的ATP读数。鉴定管中的ATP读数变化大于初始读数2倍以上表示耐药，小于2倍则是敏感。

1.2.5 统计学方法：利用SPSS18.0软件进行统计分析。

2 结果

2.1 标准菌株（H37Rv）和堪萨斯分枝杆菌的最小抑菌浓度

经过试验发现三磷酸腺苷发光检测法中标准菌株的 MIC为50μg／ml（表1）。

表1 标准菌株在含PNB的ATP培养管中的生长情况

堪萨斯分枝杆菌在PNB浓度100－1500μg／ml的范围内生长不受抑制（表2）。

表2 堪萨斯分枝杆菌在含PNB的ATP培养管中的生长情况

根据以上结果，我们以500μg／ml作为三磷酸腺苷发光法鉴定结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌的PNB界限浓度。

2.2 临床分离菌株L－J法和三磷酸腺苷发光法结果的比较

从实验结果得出（表3）两种方法的符合率为94.5%（52／55），在3株L－J法检测为 NTM 而三磷酸腺苷发光法检测为MTB的标本中，经分子生物学方法检测，在有疑问的三株菌株中有两株为NTM一株为MTB，其他52株菌株鉴定无误。因此三磷酸腺苷发光法的准确率为98.2%（54／55），传统L－J法的准确率为96.4%（53／55）。

对检测时间进行比较，L－J法检测从接种到有可见菌落长出的时间为17.87±5.73天，三磷酸腺苷发光法检测时间为6.16±1.62天。三磷酸腺苷发光法检测时间较L－J法明显缩短，两者比较有统计学差异（P＜0.001）。

表3 55例临床菌株两种方法的比较

3 讨论

非结核分枝杆菌（Non－Tuberculous Mycobacteria，NTM）广泛存在于土壤、水等自然环境中。有研究统计，在HIV阴性的NTM感染者中有46%的患者与农业有关［7］，这一现象与劳动中伤口接触存在NTM的土壤和水源有直接关系。目前，非结核分枝杆菌的发现和报道主要来自于一些不是结核病高负担的国家，而结核病流行的国家则少见报道，其主要原因在于结核流行的国家大多为发展中国家，缺少必要的检测设备和方法。由于感染NTM的症状没有特异性，和结核病感染的症状很相似，大多数时候仅仅根据痰检找出抗酸杆菌就开始按照抗结核方案治疗［8］，然而NTM对部分有时甚至全部抗结核药物天然耐药［9］，这将导致感染NTM的病人病情恶化，加重国家的负担。因此，及时有效的区别NTM感染是十分必要的。

当前，实验室区分非结核分枝杆菌的方法只要用L－J PNB法，该方法是根据PNB在500μg／ml的浓度下选择性抑制结核分枝杆菌生长而对非结核分枝杆菌不抑制来做鉴定，一般需要28天才能给出报告。在本实验中，即使对55例标本每天观察培养管的生长情况也需17.87±5.73天的时间才能给出结果，这么长的报告时间必将会导致延误治疗甚至是错误治疗。所有微生物体内都含有一定量的ATP，ATP与荧光素酶混合后能产生荧光，并且产生荧光的强度与ATP的含量成正比。三磷酸腺苷发光法是在传统的PNB特性上融入了这一原理，在PNB培养管中如果有菌生长，则其ATP的含量将会越来越高，反之不生长，其ATP的含量则下降。三磷酸腺苷发光法是通过仪器检测不需要肉眼识别，所以此方法在不增加检测成本的情况下大大降低了检测所需的时间（6.16±1.62天），减少人为判断的误差，可以更快更准确的给临床提供结果，从而减少NTM感染病人的误诊和错误治疗。

随着AIDS的流行，NTM的感染也越来越多，人们对它的关注也越来越重视。三磷酸腺苷发光菌型鉴定法有着操作简便、成本低且速度快等优点，在非结核分枝杆菌的实验室诊断应用上存在巨大的潜力。

［1］Gopinath K，Singh S.Non－tuberculous mycobacteria in TB－endemic countries：are we neglecting the danger？［J］.PLoS Negl Trop Dis，2010，274（4）：e615.

［2］Kimerling ME，Schuchter J，Chanthol E，et al.Prevalence of pulmonary tuberculosis among HIV－infected persons in a home care program in Phnom Penh，Cambodia［J］.Int J Tuberc Lung Dis.2002，6：988.

［3］Gopinath K，Singh S.Multiplex PCR assay for simultaneous detection and differentiation of Mycobacterium tuberculosis，Mycobacterium avium complexes and other Mycobacterial species directly from clinical specimens［J］.Appl Microbiol，2009，107：425.

［4］Chilima BZ，Clark IM，Floyd S，et al.Distribution of environmental mycobacteria in Karonga District，northern Malawi［J］.Appl Environ Microbiol，2006，72：2343.

［5］Chen FC，Godwin SL.Comparison of a rapid ATP bioluminescence assay and standard plate count methods for assessing microbial contamination of consumers＇refrigerators［J］.J Food Prot，2006，69：2534.

［6］中华医学会.临床技术操作规范［M］.人民军医出版社，2004：36－44.

［7］Chetchotisakd P，Kiertiburanakul S，Mootsikapun P，et al.Disseminated nontuberculous mycobacterial infection in patients who are not infected with HIV in Thailand［J］.Clin Infect Dis.2007，45：421.

［8］Gopinath K，Manisankar M，Kumar S，et al.Controlling multidrug－resistant tuberculosis in India［J］.Lancet.2007，369：741.

［9］Griffith DE，Aksamit T，Brown－Elliott BA，et al.An official ATS／IDSA statement：diagnosis，treatment，and prevention of nontuberculous mycobacterial diseases［J］.Am J Respir Crit Care Med，2007，175：367.