母乳及婴儿血液、尿液人巨细胞病毒DNA检测在婴儿HCMV感染中的应用

赵巍松，刘 伶，杨 飞

（马鞍山市市立医疗集团 临床检验中心，安徽 马鞍山243000）

人类巨细胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）是一种双链DNA病毒，属于人类疱疹病毒，HCMV在自然人群中感染非常普遍，发达国家的感染率为30－70%，我国人群的感染率在80%以上［2］，一般表现为无症状的潜伏感染［3］。HCMV是引起先天性及围生期感染的重要病原微生物之一，可通过胎盘、产道、母乳或血液直接传播给婴儿，导致死胎、流产、早产和生长发育迟缓及畸形等，严重影响胎儿的健康［4］，在免疫系统发育不完善的婴儿及免疫缺陷者中可发生严重感染并可致死亡。该病毒可持续数年之久，对机体造成严重危害。据统计，在欧美新生儿HCMV先天感染率为0.2－2.2%，其中出生时即有症状者占10－15%，无症状的婴儿中有10－15%遗留后遗症，如智力迟缓、耳聋和视力损害。由于临床表现缺乏特异性，实验室建立快速、灵敏且特异的检测技术对儿童HCMV感染的早期诊断与治疗至关重要［5］。近年来发展起来并应用的各种检测方法因有其各自的缺陷，尚不能完全满足临床早期、快速诊断的需要。本研究采用的荧光定量PCR（FQ－PCR）技术，是近年来发展起来的分子生物学领域中新一代检测技术，具有简便、快速、敏感度高等特点，是目前诊断HCMV感染的最敏感方法。我们通过对HCMV感染疑似患儿尿液、外周血白细胞以及与其配对的母乳进行巨细胞病毒核酸检测，以研究母乳的传染性和母婴传播率。

1 材料与方法

1.1 研究对象

106例来自2009年2月至2010年12月在我院收治的通过母乳喂养的疑似HCMV感染患儿和母亲乳汁标本，年龄范围在1天－12月婴儿，纳入标准参考1999年中华医学会儿科分会制定的CMV感染诊断方案［6］。

1.2 研究方法

1.2.1 标本采集 采集疑似患儿静脉血，同时留取患儿新鲜尿液3ml于无菌的干燥管中。母乳采集用自我挤压法（不用吸奶器），在清洁乳头分数次挤出3－5ml乳汁入无菌管中，立即送检。

1.2.2 标本处理 乳汁标本：充分混匀乳汁，然后吸取1.0ml置无菌离心管，12 000rpm／min，离心5 min弃上清及脂层，取沉淀。尿液标本：取1ml置于无菌管中，12 000rpm／min离心10min，弃上清，取沉淀。血液标本：EDTA抗凝血1ml，加淋巴细胞分离液分离白细胞。处理后的3种标本用试剂盒提取DNA模板，加入已配好反应体系的反应管。

1.2.3 试剂与仪器 HCMV核酸扩增（PCR）荧光定量检测试剂盒由中山大学达安基因诊断中心提供，引物序列为F5′－GCTAACTATGCAGAGCATGTA－3′，R5′－GCTGAGTTCTTGGTAAAGAAC－3′。仪器采用美国Perkin Elmer公司7300全自动PCR分析仪。

1.2.4 扩增条件 93℃2min预变性，然后按93℃45s→55℃60s，先做10个循环，最后按93℃30s→55℃45s，做30个循环。反应结束后电脑自动分析结果［7］。

1.3 诊断标准

（1）阴性结果判定：增长曲线不是典型的S曲线。（2）阳性结果判定：如果增长曲线呈典型的S曲线且HCMV－D N A＞1×103拷贝／ml。

1.4 统计方法

用SPSS17.0统计软件对实验数据进行分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 疑似HMCV感染患儿血、尿检测结果比较

对106份血标本和尿标本进行了FQ－PCR检测，其中，血液检测中HCMV－DNA阳性的有47例占44.34%，尿液FQ－PCR检测 HCMV－DNA 阳性61例占57.55%，两种方法同时阳性的有35例占12.26%。两种检测方法比较，P＜0.05，两种方法具有显著差异。尿检阳性率高于血检。

2.2 106份母乳与配对患儿检测结果比较

母乳检测中HCMV－DNA阳性的有68例，阴性38例，阳性率为64.15%。其中，在患儿尿液HCMV－DNA阳性的61例中，配对的母乳阳性共54例，占88.5%（54／61），患儿尿液 HCMV－DNA阴性的45例中，配对母乳阳性共14例，占31.1%（14／45），两者比较，P＜0.05，差异有显著意义。在患儿血液HCMV－DNA阳性的47例中，配对的母乳阳性共36例，占76.6%（36／47），患儿血液 HCMV－DNA阴性的59例中，配对的母乳阳性共32例，占54.2%（32／59），两者比较，P＜0.05，差异有统计学意义。见表1和表2。

表1 尿检患儿及配对的母乳HCMV－NDA检测结果

表2 血检患儿及配对的母乳HCMV－NDA检测结果

3 讨论

HCMV在自然人群中感染普遍，多表现为亚临床不显性感染和潜伏感染。可长期间歇地从唾液、尿液、乳汁中排出，通过多途径传播。当免疫功能低下时，病毒感染激活而发生显性感染［8］。而孕期和儿童HCMV感染较为严重，感染后几乎能侵犯机体的所有器官，是引起出生缺陷和各种不可逆损伤的一个重要因素，是导致小儿先天畸形、智力低下、发育迟缓，造成多系统多脏器病变的重要病原［9］。由于小儿感染病毒后临床表现多为非特异性，若不及时诊断和治疗，会导致严重的后遗症。因此建立早期、快速、灵敏、特异、可靠的检测和诊断方法显得格外重要。FQ－PCR技术是在常规PCR技术基础上发展起来的，融汇了PCR高灵敏性、DNA杂交的高特异性和光谱技术的高精确定量的优点，是目前准确和快速的微生物定量方法，能早期、灵敏检测到HCMV－DNA，且可进行抗病毒治疗效果监测［10］。本实验采用FQ－PCR检测技术将血液和尿沉淀HCMV－DNA结果的比较显示，FQ－PCR检测尿液的阳性率为57.55%，血液阳性率为44.34%，两者比较（P＜0.05）差异有显著性，可见尿标本FQPCR检测HCMV的敏感性要高于血标本。是由于在急性感染期，肾脏的上皮细胞为病毒最易侵袭的场所，尤其是婴幼儿的肾脏上皮细胞是较敏感的组织；血标本HCMV－DNA测定阳性，而尿标本HCMV－DNA测定阴性，则可能与HCMV尿液间歇性排毒有关［11］。当HCMV进入宿主以后，通过血液传播到全身各器官，并从各感染部位排出病毒，如在尿液中检测到高浓度的HCMV则提示患者体内HCMV处于活跃期并大量复制。尿液标本取材方便，无创，易为家长和小儿接受，所以采用FQ－PCR方法对小儿尿标本检测能起到快速、简洁、灵敏的作用，对提高HCMV感染的诊断率有实际的临床意义。

有学者调查显示，育龄妇女血清抗CMV－IgG阳性率为71.65%，提示我国育龄妇女大多数感染过HCMV［12］。大多数孕妇感染后处于潜伏性感染状态，妊娠期由于体内激素变化引起病毒激活，而孕妇的血液、子宫颈分泌物是重要的传染源，导致HCMV可能通过胎盘、产道引起母婴传播。作为产后感染HCMV的来源，母乳喂养一直未受到广泛重视。本研究对通过母乳喂养的HCMV感染患儿或疑似感染患儿的母亲乳汁进行检测，显示乳汁HCMV－DNA的阳性率达64.15%与国内文献报道的结果相近［13］，其中，在患儿尿液 HCMV－DNA阳性且配对母乳阳性的占88.5%（54／61），尿液 HCMV－DNA阴性而配对母乳阳性的占31.1%（14／45）；在患儿血液HCMV－DNA阳性中，配对的母乳阳性占76.6%（36／47），患儿血液 HCMV－DNA 阴性中，配对的母乳阳性占54.2%（32／59），将其两两进行比较，具有显著差异（P＜0.05），故推测 HCMV感染母乳可能是婴儿感染HCMV的主要途径之一。

综上所述，母乳是婴儿最理想的食物，其营养价值是其他配方乳品所无法替代的，因此如何快速检测母乳是否感染HCMV，以及婴幼儿的早期诊断有着十分重要的意义。FQ－PCR的推广应用，对提高我国人口素质，实现优生优育有着深远意义。

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