不同微生物菌株产脂肪酶发酵条件优化

雒晓芳，杨成波*

（1.西北民族大学 实验中心，甘肃 兰州 730030；2.兰州军区兰州总医院 介入疼痛科，甘肃 兰州 730050）

脂肪酶也就是三酰基甘油酰基水解酶，其作用底物通常为油脂，通过催化作用可以使其产生脂肪酸、甘油和甘油单酯或二酯[1]。这个反应通常是在油-水的界面上完成的[2]，如果底物能够分散均匀或者是具有很好的水溶性，那么反应就会不明显或者是不反应。脂肪酶的应用广泛，在食品工业中，可以用于食品原料的生产，也可以用来作为食品中的添加物质[3]，还可以提高食品的品质[4]；在医药领域中可以作为诊断工具以及治疗药物[5]；在能源领域，可以用来生产生物柴油[6]；在环境治理方面，可以用脂肪酶的微生物修复功能将含有脂肪酶以及其他成分的复合制剂来作用于海中的石油，就能够很好地治理海洋中的石油污染[7]；在有机合成中的应用，利用脂肪酶的催化反应特性，即立体选择性和区域选择性，反应条件温和，无污染等，可以用来合成一些功能强大的化合物[8]。随着社会发展以及科技的进步，脂肪酶的应用前景必定会是越来越好。

实验通过分离选择能够得到了不同种的具有高效的降解石油的菌株，并且对脂肪酶的形成条件和脂肪酶活性的测定方法进行探讨，有利于工业生产脂肪酶的研究以及脂肪酶酶活测定方法多样性探讨。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 产脂肪酶菌株的筛选

微生物菌株B1、D4、L5、A6均由西北民族大学微生物实验室从甘肃陇东油田石油污染土样中分离纯化得到，经形态学特征和生理生化初步分析，4株菌均为细菌，其分子生物学鉴定有待于进一步进行。

1.1.2 培养基

营养肉汤培养基：蛋白胨5.0g/L，牛肉浸取物3.0g/L，NaCl 5.0g/L，琼脂粉15.0，pH 7.0。

发酵培养基：牛肉膏10.0g/L，蛋白胨10.0g/L，葡萄糖10.0g/L，NaCl 5.0g/L琼脂粉16.0g/L，pH 7.0。

分离培养基：NH4NO35.0g/L，KH2PO42.5g/L，Na2HPO412g/L，H2O0.5g/L，MgSO4·7H2O1.0g/L，FeSO4·7 H2O 0.01g/L，CaCl2·2H2O 0.1g/L，酵母粉0.5g/L，标准油5.0g/L，pH 5.5～6.0；按照《微生物学实验》配制[9]。

1.1.3 试剂

橄榄油：江苏省南通市黔台商贸有限公司；聚乙烯醇（polyvinylalcohol，PVA）：中国医药集团（上海）化学试剂有限公司；（NH4）2·SO4、K2HPO4、KCl、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、NaOH、无水乙醇、NaNO3等均为是国产分析纯。

1.2 仪器与设备

HVE-50高压湿热灭菌锅：日本Hirayama公司；QH2-98A全温度振荡培养箱：江苏太仓华美生化仪器厂；ES-300E电子天平：长沙湘平科技发展有限公司；DHP-9162电热恒温培养箱：上海一恒科学仪器有限公司；BCD-235型冰箱：青岛海尔股份有限公司；DK-S24电热恒温水浴锅：上海精宏实验设备有限公司；XW-80A漩涡混合器：江苏海门市麒麟医用仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 溶液的配制

2%聚乙烯醇溶液：称取10g聚乙烯醇（PVA）放入400mL蒸馏水中，置于电热炉上面加热至溶解完全，稍稍冷却后定容至500mL，再用纱布过滤，保存滤液备用。

反应底物（橄榄油乳化液）：把橄榄油与2%PVA溶液按照1∶3比例混合，用振荡器振荡3min～5min使之乳化，置于4℃冰箱保存。

0.025 mol/L磷酸缓冲液（pH7.5）：取KH2PO40.68g，加蒸馏水溶解并定容至20mL，即为甲液；取Na2HPO4·2H2O 8.95g，加水溶解并且定容至100mL，即为乙液；取甲液13mL并且倒入乙液100mL，制成pH值为7.5 浓度为0.25mol/L的磷酸缓冲液，使用前应先稀释10倍，即为实验用缓冲液。

0.05 mol/L NaOH溶液：称取NaOH 4.5g，加水溶解并定容至1000mL，用蒸馏水来稀释一倍，此时NaOH溶液浓度即为0.05mol/L。

1.3.2 菌种的富集

（1）富集培养：挑取一环新鲜斜面种子，接于营养肉汤培养基中，置于恒温培养箱，37℃培养48h。

（2）分离：从浑浊的营养肉汤培养液中取样，用无菌水作10倍稀释倍数进行稀释。取稀释倍数分别为10、100、1000的稀释液，各取0.2mL均与涂布于分离平板，颠倒培养基，于恒温培养箱中控制温度37℃作用60h。如果细菌的菌落边缘能够出现黄色的透明圈，说明这种菌株能很好的降解油脂成分。

（3）发酵培养：通过分离得到高效降油菌后，移取富集培养液1mL转移到发酵培养基中，120r/min摇床恒温37℃培养48h。

1.3.3 脂肪酶活性的测定方法

脂肪酶活性的测定采用橄榄油乳化法：用2个锥形瓶分别表示实验组（A）和空白组（B），每瓶中各加入反应底物4mL和缓冲液5mL，B 瓶中应当先加入15mL 95%vol乙醇；把两瓶均放于恒温水浴锅中，控制温度为40℃，5min后再在A、B瓶中分别添加入1mL粗提取液，作用15min后，在A 瓶中加入与B瓶等量的乙醇使反应停止，然后滴加3滴的酚酞指示剂，用碱滴定体系变为微红色即停止。

1.3.4 脂肪酶活的定义及酶活计算

脂肪酶活的定义是在一定温度和pH值条件下，水解甘油三酯每分钟生成1μmol脂肪酸的酶量，即为一个活力单位，U/mL。脂肪酶酶活的计算公式：

式中：V1为实验组所滴加碱的体积，mL；V2为空白组所用碱的体积，mL；50 为1mL 0.05mol/L NaOH 的微克分子数；n 为稀释的倍数；t 为反应所消耗的时间，min。

1.4 产酶条件优化正交试验

在前期单因素试验的基础上，以脂肪酶活力为考察指标，用可溶性淀粉、葡萄糖和蔗糖分别作为培养基中的碳源部分，用橄榄油、大豆油和甘油作为能够促进酶合成的添加物质，采用L9（34）正交试验（见表1）对菌株产酶条件进行优化。

表1 产酶条件优化正交试验因素与水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for conditions of enzyme producing optimization

2 结果与分析

2.1 B1菌株产酶条件优化

表2 B1菌株产酶条件优化正交试验结果与分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for conditions of producing enzyme optimization of B1 strain

B1菌株产酶条件优化正交试验结果见表2。由表2可知，对B1菌种产脂肪酶活力的强弱作用分别为油含量＞碳源种类＞油种类＞碳源含量。当加入10g/L的蔗糖+12.0g/L的橄榄油时，脂肪酶活力最高可达31.667U/mL。李鑫玲等[10]关于脂肪酶产酶条件优化的研究表明，蔗糖能有效促进脂肪酶的产生。

2.2 D4菌株产酶条件优化

D4菌株产酶条件优化正交试验结果见表3。由表3可知，通过比较R值的大小，对于D4菌种酶合成的影响性大小的因素分别是碳源种类＞碳源含量＞油含量＞油种类。当培养基中加入5.0g/L的可溶性淀粉+8.0g/L的橄榄油时，酶活性最高为51.667U/mL。雷晓燕等[11]有关产酶条件优化的研究表明淀粉+植物油有利于脂肪酶的产生。

表3 D4菌株产酶条件优化正交试验结果与分析Table 3 Results and analysis of orthogonal experiments for conditions of producing enzyme optimization of D4 strain

2.3 L5菌株产酶条件优化

L5菌株产酶条件优化正交试验结果见表4。由表4可知，通过比较R值的大小，对于L5菌种酶合成的影响性强弱的因素分别是油含量＞碳源种类＞油种类＞碳源含量。当培养基中加入10.0g/L的可溶性淀粉+12.0g/L的橄榄油时，酶活力最高为36.334U/mL。余琼等[12]报道橄榄油能够很好的诱导相应的菌株产脂肪酶，当培养基中加入了糖类或者是非植物油时，能够使脂肪酶的合成量减少。

2.4 A6菌株产酶条件优化

A6菌株产酶条件优化正交试验结果见表5。由表5可知，通过比较R值的大小，对于A6菌种酶合成的影响性大小的因素分别是油种类＞碳源含量＞碳源种类＞油含量。当培养基中加入5.0g/L的蔗糖+8.0g/L的橄榄油时，酶活力最高为23.334U/mL。

表4 L5菌株产酶条件优化正交试验结果与分析Table 4 Results and analysis of orthogonal experiments for conditions of producing enzyme optimization of L5 strain

表5 A6菌株产酶条件优化正交试验结果与分析Table 5 Results and analysis of orthogonal experiments for conditions of producing enzyme optimization of A6 strain

3 结论

通过正交试验可知，B1菌种产脂肪酶活力的强弱作用分别为油含量＞碳源种类＞油种类＞碳源含量；D4菌种合成酶的影响因素分别是碳源种类＞碳源含量＞油含量＞油种类；L5菌种合成酶的影响性强弱的因素分别是油含量＞碳源种类＞油种类＞碳源含量；对于A6菌种来言，酶合成的影响性大小的因素分别是油种类＞碳源含量＞碳源种类＞油含量，由此可知，碳源种类和油含量对各种菌株产酶的影响较大。

4种细菌中，D4、A6菌株在油种类和油含量为8.0g/L的橄榄油，出现最大的脂肪酶活性，其中D4菌株的最适碳源条件为5.0g/L可溶性淀粉粉，而A6的最适碳源条件是5.0g/L蔗糖，且D4的产酶活性最高。B1、L5菌株的培养基中加入10.0g/L的可溶性淀粉和12.0g/L的橄榄油时酶活性最大，有研究表明蔗糖这类的速效碳源有利于细菌的脂肪酶的产生，并且碳源种类及含量，油种类和含量等等因素对两种细菌影响的强弱性是一致的，均为油含量＞碳源种类＞油种类＞碳源含量。

通过分离选择得到了具有高效的降解石油的不同菌株，并且对脂肪酶的形成条件和脂肪酶活性的测定方法进行探讨，有利于工业生产脂肪酶的研究以及脂肪酶酶活测定方法多样性探讨。对发酵培养基的优化，显著提高了其发酵液的脂肪酶活力，希望能为扩大脂肪酶的生产源提供一定的基础资料[13-15]。

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