高效液相色谱-串联质谱联用法(HPLC-MS/MS)同时测定辣椒制品中的10种工业染料

龙四红，梁桂娟*，李红洲，肖 洋，孙 棣

（贵州省产品质量监督检验院，贵州 贵阳 550003）

工业染料是用于纺织品、皮革制品及木制品的染色的物质，因价格便宜、着色强、稳定性强，所以也被不法商贩用作替代食品染料的着色剂。非法添加到食品中而被广为熟悉的工业染料包括苏丹红、罗丹明B、碱性橙、碱性嫩黄、酸性橙等。工业染料都是具有一定毒性的化学品，很多具有高毒性、高残留和“三致”等副作用，添加了工业染料的食品会对人体造成严重的危害。2008年12月卫生部发布的《食品中可能违法添加的非食用物质和易滥用的食品添加剂品种名单（第一批）》中明确将苏丹红、罗丹明B（玫瑰红B）、碱性嫩黄等工业染料列入非食用物质名单。

在众多的工业染料中，仅苏丹红、罗丹明B等少数几种物质有国家或行业检测标准[1-5]，文献报道的也大多数是采用高效液相色谱法检测[6-9]。由于辣椒制品中基质较为复杂，用高效液相色谱法容易出现干扰峰，从而给结果的判定造成困扰。高效液相色谱-串联质谱联用法具有灵敏度高、专属性强等的特点[10-15]，本研究旨在针对辣椒制品中容易被非法添加的10种工业染料，建立准确、简便、快捷的液质联用检测方法，为食品质量监管部门提供准确、及时的科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

碱性橙Ⅱ标准品（纯度≥99%）、碱性嫩黄标准品（纯度≥97%）、罗丹明B标准品（纯度≥97%）、酸性橙Ⅱ标准品（纯度≥98%）、苏丹红Ⅰ、苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅲ、苏丹红Ⅳ（纯度分别≥90.5%、90.0%、96.0%、92.0%）标准品：Dr.Ehrensforfer GmbH Germany公司。

甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯）、甲酸（色谱纯）等试剂：德国Merck公司。

辣椒制品样品：购于当地农贸市场。

1.2 仪器与设备

TSQ QUANTUM ULTRA高效液相色谱-串联质谱仪：美国Thermo公司；Mnltireax振荡混匀器：德国Heidolph公司；Allegra X-22R冷冻离心机：美国贝克曼库尔特公司。

1.3 实验方法

1.3.1 标准储备溶液的配制

准确称取0.1g（精确至0.0001g）碱性橙Ⅱ、碱性橙21、碱性橙22、碱性嫩黄O、罗丹明B、酸性橙Ⅱ、SUDANⅠ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ标准品。碱性橙Ⅱ、碱性橙21、碱性橙22、碱性嫩黄O、罗丹明B、酸性橙Ⅱ用10mL水溶解后用乙腈定容至100mL；苏丹红Ⅰ、苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅲ、苏丹红Ⅳ用乙腈溶解并定容至100mL，分别配制成1mg/mL的各目标物标准储备溶液。

1.3.2 样品前处理

称取经组织捣碎机捣碎并混合均匀的样品2g（精确到0.01g），置于50mL聚四氟乙烯离心管中，加入10mL乙腈均质30s后充分振荡提取20min，8000r/min、低温（5℃）离心5min，上清液过0.22μm滤膜待测。

1.3.3 空白基质工作使用溶液的配制

称取2g（精确到0.01g）空白辣椒制品，加入不同体积的标准储备溶液，按1.3.2的样品处理方法进行操作，使得空白样品中10种工业染料的最终浓度为0.1ng/mL、0.5ng/mL、1.0ng/mL、2.0ng/mL、5.0ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL。

1.3.4 仪器条件

液相色谱条件：液相色谱柱Thermo Hypersil GOLD（100mm×2.1mm，粒径 3μm）；柱温30℃；流速400μL/min；进样量10μL；梯度洗脱条件见表1。

表1 梯度洗脱程序Table1 program of gradient elution

质谱条件：正离子模式（electrospray ionization，ESI+）和负离子模式（electrospray ionization，ESI-）同时采集，喷雾电压3000V，蒸发气温度350℃，离子传输毛细管温度270℃，鞘气压力4.5MPa，辅助气压力0.5MPa，扫描模式：选择反应监测模式（select reaction monitoring，SRM）。各目标物质定性定量离子对及优化后的质谱参数见表2。

1.3.5 样品测定

将上述空白基质标准溶液和待测样液在1.3.4的仪器条件下，用HPLC-MS/MS方法测定。

1.3.6 定性及定量

表2 10种工业染料的质谱条件Table 2 Mass spectrometric conditions of ten kinds of dyes

在表2仪器条件下对基质加标溶液和样品溶液进行测定，根据目标化合物的保留时间和定性定量离子所对应色谱峰面积的相对丰度进行定性。要求待测化合物的保留时间与标准溶液中化合物的保留时间一致（标准偏差小于20%），同时要求待测试样中目标化合物的定性定量离子所对应的色谱峰面积之比与标准溶液中目标化合物的定性定量离子所对应的色谱峰面积之比一致，即当相对丰度＞50%、20%～50%、10%～20%、＜10%时，容许偏差分别为20%、25%、30%和50%。以标准溶液浓度对定量离子对的峰面积绘制标准曲线，外标法定量。

2 结果与讨论

2.1 样品前处理方法的确定

为探索简便、快速、适用范围广且回收率高的前处理方法，本研究对提取溶剂、提取时间等进行了探索。对比了不同体积分数的甲醇/水、乙腈/水对样品的提取效率，发现纯乙腈对10种染料的综合提取率最高且在20min后提取率达到最大。因此选择乙腈作为10种工业染料的提取溶剂。

2.2 色谱与质谱条件的优化

实验研究的10种目标物质中，酸性橙Ⅱ采用负离子模式，其余9种采用正离子模式，因此选择正负离子同时采集模式，扫描模式采用SRM选择反应监测模式。通过在流动相中加酸后发现，7种正离子模式采集的物质灵敏度均有较大幅度的提高，而对负离子模式采集的酸性橙Ⅱ影响不明显。对比了0.1%甲酸水-甲醇，0.1%甲酸水-0.1%甲酸乙腈后，发现从分离时间、分离效果，灵敏度等方面，0.1%甲酸水-0.1%甲酸乙腈都要优于前二者，故采用0.1甲酸水-0.1%甲酸乙腈的流动相体系。各目标物质的质谱图见图1。

图1 10种工业染料物质标准品的质谱图Fig.1 Mass spectra of ten kinds of industry standard dyes

2.3 10种染料物质的线性方程、线性范围、相关系数及其检出限

为消除辣椒制品带来的基质效应影响，采用空白基质加标的方式制作标准曲线。对空白基质加标工作溶液在1.3.4的仪器条件下进行测定，得到其线性方程及相关系数。按信噪比S/N=3以及本方法的定容体积和取样量，计算其检出限。线性方程、线性范围、相关系数及其检出限见表3。

表3 线性方程、相关系数、线性范围与检出限Table 3 Linear ranges,regression equations,correlation coefficients and limit of detection(LOD)

由表3可知，10种工业染料在各自的线性范围内呈现良好的线性关系，相关系数R2为0.9963～0.9999，检出限在1.0μg/kg～5.0μg/kg。

2.4 方法的回收率与精密度

对样品进行高、中、低3种浓度水平的加标回收率实验，每一水平重复测定3次，加标回收率、相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）结果见表4。

表4 方法的回收率及重现性(n=3)Table 4 Results of recovery rate,relative standard deviation(RSD)

由表4可知，用该方法对辣椒制品中的10种工业染料进行测定，加标回收率介于71.4%～102.9%之间，相对标准偏差均小于10%，满足方法学要求。

2.5 样品的测定

在对40个批次的油辣椒制品检测中，发现2个批次的样品中检出苏丹红Ⅰ，含量分别为45μg/kg和70μg/kg，1个批次检出罗丹明B，含量为63μg/kg。

3 结论

建立了高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS）快速检测食品中10种工业染料的方法。实验表明，该方法前处理简单，简便灵敏，准确快速，10种工业染料在各自的线性范围内呈现良好的线性关系，相关系数（R2）在0.9963～0.9999，检出限为1.0μg/kg～5.0μg/kg，加标回收率为71.4%～102.9%，相对标准偏差均小于10%。适用于监管部门对辣椒制品进行日常的监督抽查和大规模的风险监测。

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[4]中华人民共和国国家标准.GB/T 19681-2005.食品中苏丹红染料的检测方法高效液相色谱法[S].北京：中国标准出版社，2005.

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