从黄酒的酿造工艺上探讨氨基甲酸乙酯

孙双鸽，白卫东，2*，钱 敏，沈 棚

（1.仲恺农业工程学院 轻工食品学院，广东 广州 510225；2.华南农业大学 食品学院，广东 广州 510642）

氨基甲酸乙酯（ethyl carbmate，EC）又名尿烷（urethane），广泛存在于发酵食品[1]（如酱油、腐乳等，饮料酒如黄酒、清酒、葡萄酒、苹果酒等和蒸馏酒[2]如白兰地、威士忌等）中，早在1943年就被提出其具有潜在致癌作用[3]，后续有众多相关的研究报道。日本酒行业表态参照加拿大的卫生与福利组织规定的各类酒中的EC限量，并把清酒和我国的黄酒列入加强酒行列中，意味着中国黄酒中EC含量应低于100μg/L。然而EC在通常条件下稳定性很好，尤其在酒体中一经形成就极为稳定，很难分解，中国黄酒中EC含量部分超标的问题并没有得到很好的解决。

为了弄清黄酒中氨基甲酸乙酯的来龙去脉，从黄酒的酿造工艺上探讨黄酒中生成氨基甲酸乙酯的影响因素，同时，针对这些影响因素，对现今国内外控制氨基甲酸乙酯含量的方法也作了介绍。

1 黄酒中氨基甲酸乙酯的形成机制

最早在葡萄酒中研究发现，焦碳酸二乙酯和氨可以反应形成氨基甲酸乙酯[4]，但因焦碳酸二乙酯是一种添加剂，并非酒中EC形成的主要途径，虽然氰化物与乙醇的反应形成氨基甲酸乙酯[5]是葡萄酒中的主要途径，但因黄酒与葡萄酒酿造原料及酿造工艺的不同，葡萄酒中的氰化物在糯米中并不存在，也不是黄酒中EC形成的主要途径。黄酒中氨基甲酸乙酯形成的主要途径有如下几方面。

1.1 由氨基甲酰磷酸和乙醇反应形成氨基甲酸乙酯

有关研究发现，已发酵和未蒸馏的酒精饮料中EC的形成绝大部分是由氨甲酰化合物与乙醇自发反应生成[6]，其反应式：

H2NCO2PO3H2+C2H5OH→H2NCO2C2H5+H3PO4

氨甲酰磷酸、尿素、瓜氨酸、氨甲酸、天冬氨酸、尿素等都属于氨甲酰化合物，这些物质的醇解都会产生EC，经过实验得出EC的生成量与乙醇的浓度成正比[7]。但沈棚等[8-9]的研究发现，黄酒中EC的生成量与乙醇的浓度无正比关系。

1.2 由尿素和乙醇反应形成氨基甲酸乙酯

研究发现，黄酒和葡萄酒中绝大部分的EC是由尿素和乙醇反应生成的，其反应式：

H2NCONH2+C2H5OH→H2NCO2C2H5+NH3

尿素一直作为酵母的氮源添加到发酵液中，尤其是酿造高质量的白兰地原酒时，为了降低影响风味质量的杂醇油的生成，需添加一定量的尿素或硫酸铵等无机氮源。1976年OUGH在实验中证明了乙醇和尿素在室温条件下反应72h后产生EC[10]，人们才开始注意到葡萄酒中存在的尿素，之后一些国家已不再准许在葡萄酒生产中使用尿素。

1.3 由瓜氨酸和乙醇反应形成氨基甲酸乙酯

瓜氨酸是尿素循环与精氨酸代谢途径的中间产物，目前普遍认为瓜氨酸是氨基甲酸乙酯形成的前驱物，方若思等[9]也得出了影响黄酒发酵中EC形成的关键前体物是瓜氨酸而非尿素的结论。但也有研究结果表明，葡萄汁中氨基甲酸乙酯形成的数量并不和瓜氨酸含量呈线性关系，需进一步研究[11]。

2 黄酒酿造中氨基甲酸乙酯的形成

酿造黄酒的工艺流程：

原料→浸米→蒸饭→摊凉→拌曲→前发酵→勾兑→后发酵→压榨澄清→煎酒→装坛→陈酿

在黄酒的酿造过程中，尿素、瓜氨酸、精氨酸和鸟氨酸是尿素循环和精氨酸脱亚氨基酶（arginine deiminase，ADI）代谢途径的中间产物，是形成EC的前体物质。沈棚等[8]对客家娘酒中的EC回归分析发现，EC与尿素、瓜氨酸、精氨酸和鸟氨酸有显著的相关性，且精氨酸、尿素与EC呈负相关性，鸟氨酸与EC呈正相关性，而乙醇与EC并没有显著的相关性。酿造工艺条件对黄酒中EC和EC前体物的影响可以从以下几个方面探讨。

2.1 原料的影响

中国黄酒和日本清酒的原料为籼米、粳米、糯米等。酿造原料中尿素的水平与原料预处理紧密相关，但酿酒用米一般都是精制米，外来尿素不易带入。研究[12]表明，精制米中的尿素含量远低于原料米，随着精制水平的提高，尿素的含量逐渐降低。其中精制程度达到70%～75%的米中尿素的含量是原料米的一半。当使用流动水清洗大米2遍后，尿素的含量也会降低50%。因此提高原料米的精制程度以及加大清洗力度都可以减少尿素含量。但同时，随着原料预处理力度的加大，许多营养物质也会被清洗液一起带走[13]，造成营养物质损失。因此原料预处理必须以工艺为基础进行适当调整。

在各种酿造酒中，黄酒的尿素含量通常较高，常见市售黄酒中的尿素含量为15mg/L～35mg/L[14]。较高的尿素含量就有生成较高EC的可能，这就非常有必要降低黄酒中的尿素含量，从源头上对EC进行控制。

2.2 曲种的影响

黄酒酿造过程中的微生物主要有霉菌、酵母，乳酸菌及一些有害杂菌，其中霉菌包括曲霉、根霉、红曲霉等。霉菌或者酵母都属于真菌，其尿素循环途径和乳酸菌的ADI途径的中间产物，是合成EC的前体物质。

发酵酒中90%的EC是由尿素与乙醇反应生成的[6]，尿素的浓度显著影响发酵酒中EC含量的高低。因此为了降低EC的形成，从根本上来讲就是要减少尿素的含量。而减少尿素含量在尿素循环方面有4个途径[15]：一是原料中蛋白质；二是氨基甲酰磷酸合成酶Ⅰ，乙酰谷氨酸（acetyl glutamic acid，AGA）是此酶的变构激活剂；三是尿素循环时，控制其中间产物的代谢，尿素循环的中间产物（如鸟氨酸、瓜氨酸、精氨酸）的浓度均可影响尿素的合成速度；四是限速酶，精氨酸代琥珀酸合成酶在鸟氨酸循环各酶系中的活性最低，是尿素合成酶的限速酶。ADI途径方面，从合成途径的控制酶考虑，精氨酸脱亚胺酶，鸟氨酸氨甲酰基转移酶，氨基甲酸激酶等。

黄酒中的尿素主要是酵母菌在代谢过程中分解精氨酸而产生的[16]。发酵过程中，当底物中含有过量精氨酸时，精氨酸可在酵母菌内代谢产生过量的尿素，一部分尿素被利用，另一部分尿素不会立即进行降解，当含量积累到一定程度后，酵母菌将其从胞内释放到发酵液中，由此导致葡萄酒中尿素含量升高。日本学者[17]利用基因敲除原理构建了精氨酸酶基因缺失的清酒酵母，尿素不积累，但细胞生长速度受到明显抑制。

陈胜[18]从酒曲等样品中分离得到了发酵性能稳定且低产尿素、遗传稳定的酵母，并对其进行紫外线与γ射线联合诱变，得突变株遗传性状稳定的酵母，将突变菌株用于实验室酿造酵母，比分离所得菌尿素降低51.94%，提高了黄酒酿造的安全性。

而从低产尿素酵母的代谢途径入手，构建低产尿素酵母有以下的研究。赵然然[19]通过切断由精氨酸酶基因（CAR1）基因编码的精氨酸酶，弱化精氨酸分解生成尿素，从而降低发酵醪液中的尿素含量，进而降低酒液中EC含量。朱旭亚[20]强化了由DUR1，2基因编码的尿素降解途径，采用工程菌85DUR1，2进行实验室规模的黄酒酿造，尿素与EC含量分别比出发菌株降低了69.88%和41.26%，室温贮存150d，工程菌所酿酒中EC含量上升不明显，而在发酵性能、所酿酒的酒精度、总酸及氨基酸态氮含量等指标方面，工程菌与出发菌无显著差异。进行连续传代发酵试验表明工程菌85DUR1，2的低产尿素性状具有较好的遗传稳定性。由于新工艺黄酒生产工艺是采用纯种发酵，选育产尿素能力差的黄酒酵母菌进行发酵，能从根本上抑制尿素的形成。多数乳酸杆菌、乳酸球菌都具有分解精氨酸、分泌瓜氨酸的能力，因此对整个发酵过程的杂菌污染的控制对纯种发酵的新工艺黄酒中EC的控制有一定作用。

从精氨酸代谢酶的调控作用，有研究表明，L-鸟氨酸盐酸盐对黄酒发酵中产生的致癌物EC有一定程度的抑制作用，其作用机制可能是激发胞内鸟氨酸氨甲酰基转移酶（ornithine transcarbamoylase，OTC）活力表达，从而导致EC的前体物分解速度加快[21]。

赵雅敏[22]从EC降解菌入手，对具有EC降解能力的菌株进行了筛选，对发酵产酶条件进行优化后，活力提高了3.5倍，固定化细胞处理后EC去除率大大提高。

2.3 发酵工艺条件的影响

黄酒独特的生产工艺[24]如麦曲酿造、高温煎酒、长时储存、年份酒勾兑等都对EC的生成有直接影响。

黄酒发酵分为前发酵、主发酵和后发酵3个阶段。前发酵阶段主要是酵母增殖期，发酵作用弱，温度上升缓慢。当醅中的溶解氧基本被消耗完，酵母细胞浓度相当高时，则进入主发酵期，此阶段酒精发酵旺盛，酒醅温度和酒精浓度上升较快，而酒醅中的糖分逐渐减少。经主发酵，醪液中代谢产物积累较多，酵母的活性变弱，即开始进入缓慢的后发酵阶段，继续分解残余的淀粉和糖分，发酵作用微弱，温度逐渐降低。

根据王宾等[23]对传统黄酒发酵过程中精氨酸、瓜氨酸、鸟氨酸浓度变化规律的研究可知，乳酸发酵过程中，精氨酸含量先升高，之后开始下降，在后期阶段，菌落开始大量分解精氨酸。瓜氨酸的含量则在发酵了一段时间之后开始升高，但是相对增加较少，在酒化阶段，瓜氨酸、精氨酸含量都是先升高后降低。鸟氨酸浓度在酒化阶段和糖化阶段都是稳步升高的。而根据尿素循环，控制精氨酸含量能直接减少尿素的含量，从而降低EC含量。掌握尿素的中间产物EC的前体物质的规律，能为有效的控制EC的含量提供指导。

而在葡萄酒发酵中，温度越高发酵结束后葡萄酒中的EC含量也越高。适宜的酒精发酵温度一方面可以加快酵母代谢精氨酸产生尿素的反应，更重要的是发酵温度越高，尿素和乙醇反应生成EC的速率越快。有研究报道，温度每上升5℃，EC的生成量可提高一倍[24]。黄酒与葡萄酒虽然发酵工艺有差别，但是EC的生成量受环境影响是一致的，控制黄酒的发酵温度，能减少EC的生成量。

酿造及贮存工艺等条件也会影响前体物质尿素等氨甲酰类物质的含量，从而对发酵酒中最终EC浓度产生影响。发酵温度及陈酿过程中的通风量会影响酒液中的尿素含量[22]。然而，生产工艺条件对酒体风味、酒体风格有直接影响，故相对而言，黄酒生产企业对工艺条件的调整也大多持审慎态度。

2.3.1 勾兑的白酒对EC的影响

客家黄酒的酿造中要在拌曲一周左右添加白酒以终止糖化，乙醇是EC生成的前体物之一，此时添加的白酒其酒精度对成品黄酒中EC的含量也有一定的影响。但对此影响，目前还没有人进行研究。

2.3.2 后酵对EC的影响

后酵主要进行黄酒风味物质的沉积，包括肽和氨基酸含氮物质的生成以及酯类等风味物质的合成[25]，也是氨基甲酸乙酯缓慢生成的阶段。但是此阶段从工艺上控制也只能尽量降低储存温度，最多的研究是添加酶来抑制或者去除氨基甲酸乙酯。

（1）添加酸性脲酶

在后酵的过程中，可以添加酸性脲酶来分解尿素，以对EC的形成进行控制。

脲酶（urease）又称尿素氨基水解酶，在自然界中普遍存在，其可以催化尿素分解生成氨与碳酸。

因黄酒压榨后，还有勾兑澄清与煎酒的过程，在勾兑后的成品酒中添加脲酶，经一定时间处理后在煎酒时利用高温（90℃～92℃）破坏脲酶的残余活力。该方法不影响黄酒正常的生产工艺。

脲酶的添加量和作用温度是尿素分解率高低的主要原因，除此之外酒液的pH值、乙醇含量、苹果酸和氟化物的含量对尿素酶的分解效果都有一定的影响。随着脲酶添加量的增加以及作用温度的不断升高，尿素分解率迅速提高。周建弟等[26]对酸性脲酶在不同的温度、用量、时间及酒体pH值下分解黄酒中尿素的酶解特性进行了研究，表明在适宜的条件下，添加酸性脲酶可有效除去黄酒中约80%的尿素。

饮料酒通常为酸性，因此酸性脲酶才能起作用。关于酒用酸性脲酶，目前国外研究较多，早在1990年FUJINAWA S[27]等就将酸性脲酶成功应用于葡萄酒中。2001年兒玉成一等[28]证明了采用酸性脲酶降低葡萄酒中EC含量的有效性与可行性。继葡萄酒中脲酶的研究后，中国黄酒中脲酶的研究陆续展开，近几年也有所突破，2008年杨鲁强[29]对酸性脲酶进行制备、纯化，尿素的去除率达到83%；2009年王松华[30]对一株产酸性脲酶细菌进行了生理生化及分子生物学鉴定，所产酸性脲酶在黄酒中24h的尿素去除率也达到65.2%，并且初步认为是大肠杆菌属细菌中一种未报道的脲酶蛋白；2012年吕园园[31]将壳聚糖-明胶复合固定化酸性脲酶酶膜以卷式膜形式，放入层析柱中制做成酶膜反应器，黄酒中尿素去除率达54.8%，氨基甲酸乙酯含量降低率达55.6%，且未改变黄酒风味和黄酒中的多酚含量。

添加酸性脲酶不需要换酵母菌，不改变生产工艺条件和原酒风味特性，并且使用简单、见效快。在各酿造酒中，黄酒尿素的含量通常较高，因此，此方法对中国黄酒更为适用。能产生比较稳定的酸性脲酶的微生物是发酵乳杆菌。由于中国黄酒特有的复杂组分，适合其他酒种的酸性脲酶，不一定很适合中国黄酒中的应用。目前，来自乳酸菌的酸性脲酶已实现商业化应用。但我国脲酶的生产还未形成产业化，国内企业使用的脲酶主要依靠进口，脲酶纯度低是阻碍我国脲酶产业化的主要原因之一。

（2）添加酸性EC酶

EC酶即是能直接降解EC的酶，此方法降解EC方便快捷。关于EC降解酶，从1989年开始即陆续有报道，但这些EC酶通常不耐酸和醇，耐酸、耐醇的EC酶也因为其对EC的亲和力很低，不适于酒精饮料。已知可以作为酒用的EC酶来自葡萄糖酸杆菌、黄杆菌[32]、地衣芽孢杆菌[33]等，陈坚等[34]有报道产酸克雷伯氏菌可以产成黄酒用氨基甲酸乙酯酶。

2.3.3 煎酒条件的影响

把澄清后的生酒加热煮沸片刻，杀灭其中所有的微生物，破坏酶的活性，改善酒质，提高了黄酒稳定性，便于贮存、保藏，这一操作过程称灭菌，俗称煎酒。

黄酒具有独特的高温（85℃左右）煎酒工序，煎酒对黄酒的稳定性和香气形成具有重要作用。煎酒温度高，能使黄酒的稳定性提高，但酒液中的尿素和乙醇会随着煎酒温度的升高和时间的延长而加速形成更多的EC[14]。经煎酒生成的EC，对在终端进行黄酒中EC含量的控制，提出了特殊的需求。因此，在不影响黄酒风味前提下，应适当降低煎酒温度和减少煎酒时间。日本清酒仅在60℃时灭菌2min～3min，比黄酒低得多。降低煎酒温度还能减少酒精成分挥发损失，减少糖和氨基化合物反应生成的色素物质，焦糖含量。因此在保证微生物被杀灭的前提下应适当降低煎酒温度。目前各酒厂的煎酒温度普遍在85℃～95℃。各生产厂家都凭经验掌握煎酒时间，没有统一标准。

2.3.4 陈酿条件的影响[14]

中国黄酒的储存多在自然条件下，经适当储存后酒质改善，且对黄酒香气口感的提高具有较大作用，而贮酒时间的延长也伴随着EC含量的增加。经储存后的黄酒中已生成一定量的EC，这部分EC也同样对在终端进行黄酒中EC的控制，提出了特殊需求。适当降低储酒温度，对控制EC的含量是有利的。

2.4 直接减除技术

EC直接去除方面很少有人研究，能直接去除EC也是个好方法，其难点在于专一的去除EC，同时能很好的保持酒的风味。

刘俊等[35]对各种吸附性材料中优选得特异性功能树脂材料L2、L3，复配后以添加量10%（v/v）处理酒样，对黄酒中的EC去除率在60%以上，基本达到EC限量要求，同时对酒体风味的保持较好。

3 小结与展望

黄酒中氨基甲酸乙酯的研究目前还在发展阶段，EC含量与瓜氨酸、精氨酸、尿素、乙醇的相关性各研究人员各执一词。借鉴国外控制酒类饮料中EC含量的方法，找出适合中国黄酒的微生物、酶、工艺条件等控制EC含量的途径仍在研究中，而控制最直接、最简便、最廉价，并且适用于工业大规模生产的方法目前看来仍是路长漫漫。不过随着科学技术的发展、在研究人员的不断努力下，一定可以采取措施将黄酒中EC的含量控制在最低值，并且出台中国黄酒中EC的限量标准，以保证人民身体健康，将中华民族黄酒文化继续传承下去。

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