传统发酵饮料博扎中酵母菌的分离和鉴定

吾尔恩·阿合别尔迪，杨晓绒，木古丽，焦子伟

（伊犁师范学院 化学与生物学院，新疆 伊宁 835000）

博扎（柯尔克孜语勃左）是一种用小米粉自然发酵而成的发酵饮料，其制作和保藏工艺天然传统，是一种酒精度低、糖度低、质地浓稠的天然发酵饮料。博扎的起源可追溯到居住于前奥托曼土耳其的古老民族，作为一种健康饮品延续至今，不仅在其原产地仍然盛行，而且广泛传播至美洲、亚洲等地区，至今只有在我国新疆部分地区的柯尔克孜族家庭中仍保留着制作和饮用博扎的习惯[1]。

长期饮用博扎可助消化，治疗胃病、高血压、冠心病等。博扎含酒精很低，既有醪糟的长处，又有啤酒的优点。从酿制、用料、加工到酒的形态都和醪糟都很相似[2]。

目前含醇饮料的消费趋势已经向低醇化、营养化及功能化方向发展，因此应扩大和加强对博扎，尤其是对其微生物成分的研究，可丰富我国益生菌资源库。有关博扎中微生物成分的报道较少，努尔古丽·热合曼等[1]报道博扎中有植物乳杆菌（Lactobacterium plantarum）、短乳杆菌（Lac tobacillus brevis）、蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）、巴氏醋酸杆菌（Acetobacerpasteurianus）、啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）等微生物成分。因为自然环境和工艺制作的差异、原料的不同，各地区博扎中微生物种类可能也不同。从伊宁市三家博扎店采3个样品，分离和鉴定其中的酵母菌对博扎的研制提供科学依据。

1 材料与方法[3]

1.1 材料与试剂

1.1.1 样品来源

采自新疆伊宁市塔尔米为原料的市售博扎，采集后置于4℃冰箱保存。

1.1.2 培养基[4-13]

酵母菌富集培养基，马丁氏培养基，豆芽汁葡萄糖培养基，麦氏培养基，玉米粉琼脂培养基，葡萄糖（乳糖、蔗糖）发酵培养基，油脂培养基，明胶液化培养基，硝酸盐还原试验培养基，石蕊牛奶培养基，同化碳源基础培养基，同化氮源基础培养基等。

1.2 仪器与设备

GHP-9050隔水电热恒温培养箱：上海艾牧生物科技有限公司；YXQ-LS-T5SII型立式压力蒸汽灭菌器：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；GRC-200恒温振荡培养箱：上海新苗医疗器械制造有限责任公司；HC-3018R高速冷冻离心机：安徽中科中佳科学仪器有限公司；FA1004-HANGPING电子天平：上海天平仪器厂；ZHJH-2109C水平流超净工作台：上海智城分析仪器制造有限公司；MC-SP21105多功能电磁炉：广州美的生活电器制造有限公司；扬天T2900D微型计算机：联想（北京）有限公司；SFC-288生物显微镜：麦克奥迪实业集团有限公司。

1.3 方法

1.3.1 分离纯化酵母菌

首先通过酵母菌富集培养基，于28℃富集培养24h。然后将富集培养后的菌株接入马丁氏培养基中，培养48h，将培养后长出的单个菌落分别挑取少许菌苔接种在豆芽汁葡萄糖培养基的斜面上纯化，纯化2～3次，置于4℃冰箱中保存备用。

1.3.2 酵母菌的鉴定

酵母菌的鉴定程序、方法参考文献[6，14-15]。

酵母菌的形态观察：

（1）菌落特征的观察

肉眼观察生长在豆芽汁葡萄糖平板上的酵母菌菌落，根据菌落大小，菌落颜色，菌落形态进行描述。

（2）观察出芽生殖

在载玻片上滴1滴蒸馏水，挑取少量酵母放入蒸馏水中，制成临时装片，观察菌体细胞的大小与出芽方式。

（3）观察子囊孢子

①将酵母接种于豆芽汁培养基中，于28℃～30℃培养24h，然后连续传代3～4次，最后转接到麦氏培养基，在25℃～28℃培养3d左右，使其形成子囊孢子；

②从形成子囊孢子的菌落中，取出少量菌体，在载玻片上制作涂片，干燥、固定后，在涂菌处滴5%孔雀绿染液，10min后用水冲洗，再用0.5%番红染液复染1min；

③将涂片置于显微镜下，观察子囊孢子的形状、特点。（4）假菌丝形成

新培养物划线接种于玉米琼脂培养基上，25℃～28℃培养3d～5d，制成临时装片，置于显微镜下观察。

酵母菌生理生化特征检测：

（1）糖类发酵实验

糖类选用葡萄糖、蔗糖、乳糖制备培养基，用1.6%溴甲酚紫溶液将培养基调至紫色，115℃、30min灭菌（灭菌后加10%糖液），接种，置于37℃恒温箱内培养24h，另一支管不接种作为对照，观察酵母菌对不同糖类的发酵产酸能力。

（2）油脂水解实验

配制油脂培养基时，预先加入中性红指示剂或溴甲酚紫指示剂来完成检验，将油脂固体培养基融化后，充分振荡（使油脂分布均匀）倾入无菌空白培养皿，凝固后制成平板，接种，培养48h，观察培养基中的脂肪是否被分解。

（3）碳源同化测定

使用生长谱法测定碳源同化。

①制备菌悬液：3mL～5mL无菌生理盐水倒入斜面，洗下菌苔，4000r/min离心15min，加无菌生理盐水洗涤，4000r/min离心30min，最后用无菌生理盐水10mL，制成菌悬液，30℃振荡培养24h；

②制混菌平板：取1mL菌悬液和融化后冷却至50℃左右的基础培养基倾注于无菌培养皿中，制成混菌平板，于30℃培养3h。平板底面预先划区，标记滴加的糖类名称；

③加糖液：取出培养3h的混菌平板，用浸泡过葡萄糖、蔗糖、乳糖的小圆滤纸片，分别放在平板上已划分好的位置上，30℃恒温培养箱继续培养24h，观察酵母菌对不同碳源的利用情况。

（4）氮源同化测定

生长谱法测定氮源同化：①制备菌悬液②制混菌平板③培养基中分别加入0.78%硝酸钾、0.78%硫酸铵，接种，30℃恒温培养箱继续培养24h，观察酵母菌对不同氮源的利用情况。

制备明胶培养基，用穿刺法接种酵母菌，置于20℃～22℃恒温箱内培养4d～5d，观察培养后的明胶培养基的变化。

（5）硝酸盐还原试验

将酵母菌接种于硝酸盐液体培养基中，将3支管置于37℃恒温箱，培养1d、3d、5d，另外一支管不接种作对照。取干净的空试管，在试管中倒入少许培养基液，再滴一滴A液及B液，在对照管中同样加入A、B液各一滴，观察颜色反应（溶液如变为粉红色、玫瑰红色、橙色、棕色等表示有亚硝酸盐存在，为硝酸盐还原阳性）。

（6）明胶液化试验

利用明胶作为凝固剂的培养基，用穿刺法接种酵母菌，置于20℃～22℃恒温箱内培养4d～5d，观察培养后的明胶培养基的变化。

（7）牛奶胨化试验

①配制牛奶石蕊培养基：脱脂牛奶粉100g，石蕊0.075g，蒸馏水1000mL，混合后的颜色呈丁香花紫色为适度，pH6.8，121℃灭菌15min。

②分装试管，接种，置于37℃恒温箱内培养7d，另外保留一支不接种的石蕊牛奶培养基作为对照。

2 结果与分析

2.1 酵母菌的个体形态学特征观察结果

将自然发酵饮料博扎的10-4、10-5和10-63个浓度的稀释液经富集培养后，在马丁氏培养基中培养48h，再在豆芽汁葡萄糖培养基中培养48h，纯化2次，观察菌落特征，借助显微镜来观察酵母菌的出芽生殖及假菌丝，再对其进行接代培养，结合显微镜观察子囊孢子，结果见表1。

表1 菌落形态和细胞形态结果Table 1 Results of colony shape and cellular morphology

酵母菌的个体形态大小、出芽方式、能否产生假菌丝以及子囊孢子形成能力，是酵母菌鉴定的重要依据。结果显示，酵母菌大多呈圆形、卵圆形、椭圆形，长约5.4μm，Y4、Y6、Y9、Y10均产生了菌丝，Y3、Y5、Y11均能产生卵圆形子囊孢子，Y1、Y2、Y4、Y6、Y7、Y8、Y9、Y10、Y12未能观察到子囊孢子的形成。

2.2 酵母菌的生理生化特征测定结果

2.2.1 酵母菌的糖发酵结果

分别选取葡萄糖、蔗糖、乳糖进行糖发酵实验，结果见表2。

表2 酵母菌的糖发酵结果Table 2 Results of yeast sugar fermentation test

从表2可以看出，菌株Y3、Y5、Y11发酵能力较好，Y1、Y2、Y4、Y6、Y7、Y8、Y9、Y10、Y11、Y12仅对葡萄糖有发酵能力。

2.2.2 油脂水解的测定结果

在配制油脂培养时，预先加入中性红指示剂来完成产生脂肪酸的检验。经接种培养24h后，观察平板底层长菌处。结果有平板底层长菌处有红色斑点出现，则表示酵母菌产生了脂肪酶，将培养基中的脂肪分解为甘油及脂肪酸，此为正反应。说明所有酵母菌菌株具有分解脂肪的能力。

2.2.3 同化能力的测定结果

各株酵母菌对不同碳源、氮源的利用能力差异明显，结果见表3。

由表3可以看出，12株酵母菌对不同碳源、氮源的利用能力有差异，菌株Y1、Y2、Y4、Y6、Y7、Y8、Y9、Y10、Y12碳源同化葡萄糖、蔗糖，不同化乳糖，Y5、Y11碳源同化能力较弱，同化葡萄糖，不同化蔗糖、乳糖。菌株Y3、Y5、Y4、Y6、Y9、Y10、Y11氮源同化硫酸铵，不同化硝酸钾，Y1、Y2、Y7、Y8、Y12氮源同化能力较强。

表3 酵母菌的碳源、氮源同化结果Table 3 Assimilation results of yeast carbon and nitrogen source test

2.2.4 硝酸盐还原试验测定结果

硝酸盐还原是指能把培养基中的硝酸盐还原为亚硝酸盐，培养基中加入格里斯试剂时，溶液呈现粉红色、棕色、橙色、玫瑰色等。对12株菌株进行硝酸盐还原测定，菌株Y1、Y2、Y7、Y8、Y12培养基溶液呈现玫瑰红色，菌株Y3、Y5、Y11培养基溶液呈现橙色，菌株Y4、Y6、Y9、Y10培养基溶液呈现棕色。结果显示均有亚硝酸盐存在，为硝酸盐还原阳性。

2.2.5 明胶液化试验的测定结果

明胶培养基经酵母菌利用后，均由原来的固态变为液态，说明酵母菌具有分解明胶的能力，能向外分泌蛋白酶，分解明胶而产生小分子物质。

2.2.6 牛奶胨化实验测定结果

酵母菌对牛奶的利用主要是指对乳糖及酪蛋白的分解和利用。牛乳中加入石蕊作为酸碱指示剂和氧化还原指示剂，石蕊中性时呈淡紫色，酸性时呈红色，碱性时呈蓝色，还原时则部分或全部脱色。对12株菌株进行牛奶胨化培养，均呈现橙红色，说明酵母菌发酵乳糖后产酸，使石蕊牛乳变红。酵母菌具有发酵乳糖产酸能力。

3 结论

试验结果表明，Y1、Y2、Y7、Y8、Y12菌株细胞圆形或卵圆形，为两段芽殖，无子囊孢子；其发酵葡萄糖，不发酵蔗糖、乳糖；碳源同化葡萄糖、蔗糖，不同化乳糖；氮源同化硝酸钾和硫酸铵；牛奶反应阳性；明胶液化阳性；硝酸盐还原阳性。综合该菌以上特征，根据《The Yeast，A Taxonomic Study》[8]初步鉴定为真菌门半知菌亚门，芽孢菌纲隐球酵母目，隐球酵母科隐球酵母属（Cryptococcus）。

Y4、Y6、Y9、Y10菌株细胞卵圆形或圆形，两端芽殖，液具环，无子囊孢子；玉米粉培养基载玻片培养时，可见大量的假菌丝；发酵葡萄糖、蔗糖，不发酵乳糖；碳源同化葡萄糖、蔗糖，不同化乳糖；氮源同化硫酸铵，不同化硝酸钾；牛奶反应阳性；油脂分解；明胶液化阳性。综合该菌以上特征，根据D亚罗《酵母菌的特征与鉴定手册》[6]初步鉴定为真菌门半知菌亚门，芽孢菌纲隐球酵母目，隐球酵母科假丝酵母属（Candida）。

Y3、Y5、Y11菌株细胞圆形或卵圆形，周边芽殖，有1～4个子囊孢子；发酵葡萄糖、蔗糖，不发酵乳糖；碳源同化葡萄糖、蔗糖，不同化乳糖；氮源同化硫酸铵，不同化硝酸钾；牛奶反应阳性；明胶液化阳性；油脂分解。综合该菌以上特征，根据J.A.尼巴特《酵母菌的特征与鉴定手册》[9]初步鉴定为真菌门子囊菌亚门，子囊菌纲内孢霉目，内孢霉科酿酒酵母属（Scerevisiae）。

[1]努尔古丽·热合曼，华长春，朱晓莹，等.新疆柯尔克孜族传统发酵饮料博扎中微生物群落结构的PCR-DGGE分析[J].食品科学，2012，33（1）：111-114.

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