菩提树黑痣病菌生物学特性及病害发生规律

韦昌幸，黄宇豪，韦继光，吴耀军，罗辑

(1.广西壮族自治区国有高峰林场，广西南宁 530001；2.广西大学农学院，广西南宁 530004；3.广西壮族自治区林业科学研究院，广西南宁 530002)

菩提树Ficus religiosa属桑科 Moraceae 榕属Ficus常绿或半落叶乔木，树高可达15 ～25 m。 叶革质，三角状卵形，先端聚尖，延长成披针状条形尾，尾约占叶片长的1/4 ～1/3，榕果球形至扁球形，花期3—4 月，果期5—6 月[1]。 在我国主要种植于南方各省，如云南、广东、广西等地，多见于公园、寺庙等地作景观植物，也有一些城市用于行道树栽种[2]。 菩提树黑痣病影响菩提树的光合作用，导致叶片组织坏死，严重时造成大量落叶，影响菩提树观赏价值，经济效益降低[3]。 广西地处低纬度，属亚热带季风气候，气候温暖，雨水丰沛，年平均降水量841.2 ～3 387.5 mm，年平均气温17.5 ～23.5 ℃，温湿度符合菩提树黑痣病的发病条件，是菩提树黑痣病的多发地区。

黑痣菌Phyllachora repens(Corda) Sacc.属于真菌界Fungi 子囊菌门Ascomycota 粪壳菌纲 Sordariomycetes 黑痣菌目 Phyllachorales 黑痣菌科Phyllachoraceae 黑痣菌属Phyllachora的真菌[4]，是专性寄生的活体营养真菌，无法人工培养，导致对其研究受限。 至今仅见降香黄檀黑痣病的发生规律研究报道[5-6]。 目前对菩提树的研究包括造林技术[1]、繁殖技术[7-8]、病害研究[2，9-10]、引种防寒技术[11]、传粉生物学研究[12]、绿化作用[13-14]、药学研究[15]等，但未见对菩提树黑痣病的研究报道。

1 材料与方法

1.1 试验地情况 广西壮族自治区凭祥市绿化树种菩提树种植圃(N 22°6′38"，E 106°45′15")，菩提树种植面积18 hm2，树龄4 ～8 a。 该地区属高温多雨的亚热带季风型气候，年平均气温 19.5 ～21.41 ℃，极端最高气温38.7 ℃，极端最低气温-1.2 ℃。 年活动积温 7 124 ～7 836 ℃·d，无霜期约340 d。 4 月下旬进入雨季，持续到10 月上旬结束，6—8 月雨量集中，多大雨或暴雨天气，10 月至翌年4 月雨量较少。

1.2 病原菌子囊孢子液制备 将叶片上的黑痣病病斑刮下，放入10 mL 离心管中研磨处理(非破壁处理)， 加 入 3 mL 无 菌 水， 涡 旋 震 荡 3 min，4 000 r/min离心处理3 min，过滤多余杂质，取上清液，8 000 r/min 离心 4 min，弃上清液，保留 1 mL 孢子沉淀液于离心管中备用。

1.3 菩提树黑痣病发病规律 在试验地内设立3个样地，每个样地内菩提树30 株，每月从每株树上随机选取30 片叶子，调查黑痣病的发生情况，按照病害严重度分级标准(表1)计算病情指数并进行差异显著性分析。

表1 菩提树黑痣病的严重度分级标准Tab.1 The severity grade standard of tar spot of Ficus religiosa

以凭祥市气象观测中心数据为参考，从3 月份开始观察记录每日的晴雨情况，取其月平均值，根据3 个样地的观测数据，分析菩提树黑痣病的发病率和病情指数及年变化规律与温度、湿度、降水量的关系，并进行差异显著性分析。

病情指数=[∑(病级株数×代表数值)/(总株数×发病最重级的代表数值)]×100。

1.4 室外子囊孢子的捕捉 制作木盒，木盒中间插入涂上医用凡士林的载玻片，每盒放置7 块。 每个样地挂置1 个木盒，用于捕捉菩提树黑痣病病原菌子囊孢子。 每月将木盒中载玻片取回，放在显微镜下以10 ×10 倍镜观察捕捉到子囊孢子数量，每块载玻片上随机选取5 个视野，取其平均值，得到1 个月内每个区域所捕捉到的子囊孢子的相对数量。 结合田间调查，分析子囊孢子释放量与菩提树黑痣病的病情指数之间的关系[16-17]。

1.5 子囊孢子萌发的生物学特性测定 将纯净子囊孢子液滴入凹玻片的凹槽中，再分别放入8，10，13，15，17，20，22，25，27，30，32，35，38 ℃恒温光照培养箱中培养。 每个温度设3 个重复，以无菌水滴入凹玻片作对照。 36 h 后计算每个玻片上的平均孢子萌发率，确定子囊孢子萌发最适温度。

用98%浓硫酸在密闭干净的干燥器中调节空气相对湿度[18]。 将纯净子囊孢子液均匀涂抹于洁净载玻片上，快速风干后，分别置于相对湿度为50%、65%、75%、85%、90%、95%、100% 的干燥器中，以孢子在100% ＋水膜中作为试验对照，每个湿度条件分别设置3 个重复，在子囊孢子萌发最适宜温度(25 ℃)培养36 h 后，利用光学显微镜镜检子囊孢子萌发情况，确定子囊孢子最适萌发湿度。

选取蔗糖、葡萄糖、乳糖3 种碳源，硝酸铵、硝酸钠、氯化铵3 种氮源，分别配制成所需含碳量和含氮量溶液备用，碳源有效浓度40.0 ～42.5 g/L，氮源有效浓度2.59 ～2.78 g/L。 将纯净子囊孢子液分别与上述配制好的溶液混合，保证其混合后溶液浓度不变，将混合液充分混匀后滴至凹玻片上，不加入碳、氮源的孢子液作为空白对照，放入保湿器，再将保湿器放入恒温箱中培养36 h，观察孢子萌发情况，确定碳、氮源对子囊孢子萌发是否存在刺激作用。

1.6 室外接种试验 将纯净子囊孢子液放入小喷壶中。 选取室外生长无病菩提树5 株，处理组和对照组叶片都来自同一株树，共5 个处理和对照。 对无病叶片用75%乙醇擦拭表面，后用无菌水清洗3次，晾干后分2 组处理。 第一组选择10 片无病无伤叶片的半边叶片喷洒子囊孢子液，另半边叶片作空白对照，用封口袋保湿，3 d 后进行第1 次观察；第二组选择10 片无病叶片的一半叶面用昆虫针轻轻刺破，然后再喷上孢子液，另半边叶片作空白对照，用封口袋封口保湿，每3 d 观察1 次，观察其发病情况。 接种的子囊孢子液浓度为1 ×106个/mL，每片叶片接1 mL。

2 结果与分析

2.1 病情指数增长与子囊孢子捕捉的周年动态菩提树黑痣病的发病规律与菩提树生长季节是紧密相关的。 菩提树的落叶期是每年的1—2 月，3 月菩提树陆续长出新叶，新叶长出1 个月后开始出现典型病斑，在12 月至次年2 月不再长出新叶。 病情指数4—12 月呈上升趋势，期间增长量有1 个峰值，出现在6 月，而4—8 月为病情指数增长较快期。 9—12 月病情指数增长量逐步下降，1—2 月菩提树进入落叶期，病情指数增长量为0(图1)。

图1 菩提树黑痣病病情指数增长量的年变化规律Fig.1 Yearly variation of disease increase index of tar spot of Ficus religiosa

菩提树黑痣病的子囊孢子全年都在释放和传播，释放量在6 月和10—11 月形成2 个明显的高峰，且这2 个高峰期子囊孢子释放量差异不显著，其它各月子囊孢子释放量相对较少，各月间的子囊孢子释放量存在差异显著性，1 月子囊孢子释放量最小(图2)。

图2 菩提树黑痣病每月孢子捕捉量的周年变化Fig.2 Yearly variation of monthly ascospore capture of tar spot of Ficus religiosa

2.2 气象因子与孢子捕捉量及病情指数增长的关系 菩提树黑痣病病情指数增长量与平均降水量和平均空气相对湿度呈极显著关系，与温度变化呈显著关系，与平均相对孢子捕捉量呈不显著关系(表2)。 菩提树黑痣病病情指数增长量在4—7 月间持续较高，可能与这个时期多雨、空气相对湿度大以及菩提树的嫩叶多有关系。 尽管8—9 月降水量还比较多，且相对湿度都在80%以上，但此时大多数叶片为成熟叶片，嫩叶的比例小，因此菩提树黑痣病的病情指数增长变得缓慢。 10—12 月降水量相对减少，湿度下降，叶片以成熟叶为主，新发叶片很少，幼嫩叶片比例小，病害增长速度大大减缓。 病情指数增长量与子囊孢子的每月相对捕捉量没有相关关系，这说明林地内子囊孢子数量充足，不成为病情指数增长的制约因素。

表2 2017—2018 年菩提树黑痣病发生与气象因子和孢子捕捉量的关系Tab.2 The relationship between meteorological factors，ascospore capture and the severity of tar spot of Ficus religiosa in 2017—2018

2.3 病原菌生物学特性 黑痣菌子囊孢子萌发的温度为15 ～35 ℃，最适温度为 25 ℃(表 3)。 在广西，每年3—11 月都能满足子囊孢子萌发的温度要求，不成为发病的限制因素。

表3 不同温度对子囊孢子萌发的影响Tab.3 The effect of different temperature influenced ascospores germination

黑痣病菌子囊孢子萌发要求的最低空气相对湿度为90%，湿度低于90%时孢子不萌发(表4)，因此湿度大有利于子囊孢子萌发。 在广西每年6—8月进入雨季，空气相对湿度大，有利于子囊孢子的萌发，进入秋季以后，雨水减少，空气相对湿度较小，不利于子囊孢子萌发。

菩提树黑痣病菌的子囊孢子在3 种不同的碳源刺激下，孢子萌发率与对照没有明显的差异(表5)，表明菩提树黑痣病菌的子囊孢子萌发对这3 种碳源的刺激没有明显的反应。 在硝酸钠氮源的刺激下，菩提树黑痣菌子囊孢子的萌发率显著高于对照(表5)。

表4 不同空气相对湿度对子囊孢子萌发的影响Tab.4 The effect of different relative humidity on ascospores germination

2.4 室外接种 5 月室外接种子囊孢子15 d后，接种叶片出现黄褐色小点，30 d 后黄褐色小点陆续变黑凸起，形成典型症状，经形态学鉴定，接种后产生的子囊孢子与接种的子囊孢子一致。 无伤接种叶片形成黑痣典型症状的点数很多，伤口接种叶片形成黑痣典型症状的点数相对较少，同时，无伤接种的对照区也有少量几个黑痣点，属于自然感染(图3)，推断菩提树黑痣病菌的侵入途径与伤口关系不大，在自然条件下主要为直接侵染。 另外，菩提树黑痣病的潜育期较长，从接种到出现典型症状时间为30 d。

图3 室外接种子囊孢子15 d 后叶片症状Fig.3 The symptoms of leaf 15 days after inoculating ascospores outdoor

3 结论与讨论

菩提树黑痣病的发病规律与其生长季节紧密相关，病原菌的子囊孢子全年都在释放和传播，病情指数增长量受平均降水量、平均空气相对湿度及温度变化影响。 菩提树黑痣病子囊孢子萌发受温度、相对湿度影响较大，硝酸钠可刺激子囊孢子的萌发。菩提树黑痣病的潜育期较长，自然条件下侵染方式主要为直接侵染。

菩提树黑痣菌寄主单一，张中义和张陶记载菩提树黑痣病菌的寄主均为菩提树[3]，本试验对苗圃内的20 多个树种及苗圃周围的12 个树种进行了调查，除了菩提树发生黑痣病外，仅发现降香黄檀Dalbergia odorifera也有黑痣病的发生，但经切片观察子囊孢子的形态，发现降香黄檀黑痣病菌的子囊孢子与菩提树黑痣病菌的子囊孢子形状和大小有明显的区别(不同种)，说明菩提树黑痣病菌的寄主范围较单一，对其他木本植物未构成威胁。

1999 年菩提树黑痣病在中国首次出现于台湾地区[19]，本研究发现菩提树黑痣病首次在中国大陆发生，病害的传播可能与苗木调运有关，尽管此病害不属于检疫性有害生物，也要防止或减少病害的扩散，调运菩提树苗木需谨慎，谨防携带黑痣病的苗木。