中国疱衣属地衣的初步研究

徐亚男, 杨秋霞, 贾泽峰

(1. 聊城大学生命科学学院，山东 聊城 252059；2. 中国科学院微生物研究所真菌学国家重点实验室，北京 100101)

疱衣属[Phlyctis(Wallr.) Flot.]为地衣型真菌，隶属于真菌界(Fungi)子囊菌门(Ascomycota)茶渍纲(Lecanoromycetes)厚顶盘目(Ostropales)疱衣科(Phlyctidaceae)。该属在世界上分布较为广泛，主要分布于热带与亚热带地区，目前全世界已报道该属有25种[1]。1850 年，Flotow 以Phlyctis agelaea(Ach.) Flot.为模式种界定了疱衣属[2]。《中国地衣综览》收录中国该属4 种[3]，之后又报道了1 种[2]，主要分布在云南[4]、香港[5-6]、台湾[7]、湖北[8]和甘肃[2,9]等地区。

疱衣属地衣的特征是地衣体壳状，树皮生或石生，表面光滑至具有裂缝，常具初生地衣体；子囊盘通常深陷于地衣体中，近埋生或贴生，常带有白色粉霜；侧丝单一，顶端相互交织，少有分叉；子囊长椭圆状至棍棒状，内含1~8 个孢子；子囊孢子无色透明，横隔多胞或砖壁型。光合共生藻为绿藻[10-11]。

本研究基于形态学、解剖学、化学、分子生物学和生物地理学等方法，对中国疱衣属地衣进行初步研究，报道中国一新记录种：类喜马拉雅疱衣(Phlyctis subhimalayensisS. Joshi & Upreti)。

1 材料和方法

1.1 实验材料

研究标本采集地为云南，现保藏于中国科学院微生物研究所菌物标本馆HMAS-L、山东师范大学植物标本室(SDNU)、Korean Lichen Research Institute (KoLRI)和荷兰CBS 标本室(ABL)。

1.2 表型研究

在体视显微镜(Motic SMZ-168 和LEICA M125)下观察外部形态并拍照。在光学显微镜(Zeiss Axioscope 2)下对子囊器的内部结构进行观察并拍照。化学特征：利用颜色反应，使用K 试剂(10%氢氧化钾水溶液)、C 试剂(次氯酸钠水溶液)和P 试剂(将对苯二胺溶于无水乙醇，配成5%乙醇溶液)进行测试;使用标准的薄层色谱法(TLC)检测地衣中所含次生代谢物，溶剂系统为C 系统[12-14]。

1.3 基因型研究

DNA的提取扩增和测序采用CTAB 法从疱衣属标本的子囊组织中提取总DNA[15]，采用PCR扩增核糖体转录间隔区序列(ITS)，引物为ITS5/ITS4[16]。反应体系总体积为25µL，包括正反向引物各1µL，模板DNA 2µL，ddH2O 8µL 和2×TaqPCR MasterMix®13µL。扩增程序[17]为：95 ℃预变性5 min；然后94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃1 min，共34 个循环；最后72 ℃延伸10 min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，并由天一辉远(北京)生物有限公司进行测序。因研究标本较陈旧，因此，对同一份标本提取DNA 2 次，分别进行PCR扩增及测序，并作为2 条单独的ITS 序列应用于该属的系统发育树构建(表1)。

表1 地衣标本信息和ITS 序列的GenBank 登录号Table 1 Lichen specimen information and GenBank accession No.

系统发育树构建通过查阅文献，在NCBI网站下载20 条序列，与本研究的2 条疱衣属序列,共22 条序列进行系统发育分析，以疱衣科亲缘关系较近的凹盘衣科(Gyalectaceae)的Gyalecta属为外群[18]。使用BioEdit V 7.0.5 中的ClustalW Multiple Alignment 利用最大似然法(Maximum-likelihood,ML)进行比对[19-20]，使用在线网站Cipres Science Gateway (http://www.phylo.org)中的RAxML HPC V.8.2.6 构建系统发育树[21]，运算方法选择GTR+I+G模型，每个节点设置1 000 次重复以评价自展支持值。获得的系统树文件在FigTree V. 1.4.2 中查看和编辑，自展支持值(bootstrap)≥75%的分支可信(图1)。

图1 基于ITS 序列构建的疱衣属系统发育树Fig. 1 Phylogenetic tree of Phlyctis based on ITS sequences

2 结果和分析

2.1 类喜马拉雅疱衣 (新拟) 图2

图2 类喜马拉雅疱衣(HMAS-L 105300)。A: 地衣体和子囊器；B: 子囊及子囊孢子; C: 子囊孢子。标尺: A=0.5 mm; B=20 µm; C=10 µmFig. 2 Phlyctis subhimalayensis (HMAS-L 105300). A: Thallus with ascomata; B: Ascuswith ascospores; C: Ascospores. Bars: A=0.5 mm; B=20 μm; C=10 μm

Phlyctis subhimalayensisS. Joshi & Upreti,Lichenologist 44(3): 365 (2012)

地衣体壳状，上表面白色或灰白色，平滑且连续，无粉芽及裂芽，无前地衣体；共生藻为绿藻。子囊器为子囊盘，埋生于地衣体内，子囊盘数量较多，直径0.2~0.5 mm，呈分散状或2~3 个聚集在一起，近似圆形或拉长到角状，盘面呈黑色，圆形至不规则，平至凹状，具有白色粉霜，边缘灰白色,且呈叶片状。囊层基呈浅褐色至浅黄色，子实层无色，I-；侧丝较为简单，顶端相互交织，且不肿胀, 无分叉；子囊棍棒状，8 个孢子，60~73µm×12~16µm，I-；子囊孢子无色透明，梭形，具5~7横隔, 37~45µm×4~6µm，I-。

化学反应：地衣体K-，C-，KC-，P-；未检测到地衣次生代谢产物。

基物：树皮。

研究标本：云南，楚雄市，附近山上，海拔2 200 m；2002-10-26，任强301 (HMAS-L105300)。

世界分布：印度的喜马拉雅山北部和东部[22]。

讨论：该种主要特征为地衣体表面无粉芽，子囊盘表面带有白色粉霜，子囊8 个孢子，孢子横隔型，具有5~7 个横隔，囊层基呈浅褐色至浅黄色, 无地衣次生代谢产物。在图1 中，P. subhimalayensis的2 条自测序列完全一致，能够完好代表标本HMAS-L 105300。分子数据分析表明，该种与Phlyctis属其他物种很好的聚为一单系分支，支持值高达99%;且与Phlyctis属其他物种明显分开，作为独立分支,因此鉴定为P. subhimalayensis。

该种与P. himalayensis(Nyl.) D. D. Awasthi 和P. karnatakanaS. Joshi & Upreti 较为相似，子囊孢子具有7 个横隔，但在子囊孢子的大小和地衣次生代谢产物方面明显区分于后两者，P. karnatakana的子囊孢子25~35μm×4~7μm，P. himalayensis的子囊孢子60~75µm×18~24µm，二者地衣体均遇K+红色，P. himalayensis具有未知的地衣化合物，P.karnatakana具有降斑点酸(norstictic acid)[23-24]。此外，该种还与P. megalospora(P. James) D. J. Galloway & G. Guzmán 具有相似之处，这2 种的子囊孢子均呈横隔型，然而P. megalospora的孢子大小为285~390μm×79~95μm，且地衣体含斑点酸(stictic acid)和茶痂衣酸(psoromic acid)[10]。

2.2 中国已报道疱衣属物种

亮疱衣Phlyctis argena(Ach.) Flot., Bot. Ztg. 8:572 (1850)

地衣体壳状，表面被粉芽堆覆盖，带有白色粉霜，聚集在地衣体表面。子囊盘不常见，子囊单孢，子囊孢子无色透明，砖壁型，100~150μm×25~50μm。含有降斑点酸。

研究标本：台湾，南投县河谷，950 m，Aptroot 52055、53436 (ABL)。

基物：树皮。分布：台湾[6]。

讨论：该种主要特征是地衣体具有丰富的粉芽；子囊盘不常见；子囊单孢，子囊孢子砖壁型,大小100~150μm×25~50μm。本种与P. agelaea、P. speirea、P. karnatakana和P. subargena相似，如子囊盘表面都具有白色粉霜，含有降斑点酸，但这4 种地衣体表面均无丰富的粉芽[2,5,9,24]。

卡纳疱衣Phlyctis karnatakanaS. Joshi &Upreti, Bryologist 113(4): 726 (2010)。

地衣体壳状，树皮生。子囊盘直径为0.4~0.5μm,具有轻微粉霜，子囊棒状，含有8 个孢子，子囊孢子透明，横隔型，25~35μm×4~7μm，含有降斑点酸。

研究标本：云南，普洱市国家森林公园, 1 552 m,王欣宇CH130421 (KoLRI 020827)。

基物：树皮。

分布：云南[2]。

讨论：该种的子囊孢子具有7 个横隔，与P.himalayensis和P. longifera(Nyl.) D. J. Galloway &Guzmán 相似，但后两者具有较大的子囊孢子，分别为60~75μm×6~8μm 和55~86μm×5~7μm，且地衣体含有斑点酸[10,23]。该种在孢子横隔型与P. uncinata和P. communisChitale & Makhija 相近，不同点在于P. uncinata的子囊孢子50~54µm×5~7µm, 具有8 个横隔；P. communis的子囊孢子具有7~16 个横隔，含有斑点酸和水杨嗪酸(salazinic acid)[25-26]。

裂疱疱衣Phlyctis schizosporaZahlbr., in Handel-Mazzetti, Symb. Sinic. 3: 178 (1930)

地衣体壳状，灰色至淡灰绿色，子囊盘直径0.3~0.6 mm；子囊棒状，含有单孢；子囊孢子褐色，砖壁型，73~85μm×25~37μm。未检测到地衣次生代谢产物。

研究标本：湖北，神农架，2 900 m，魏江春和陈建斌10896 (HMAS-L)。

基物：竹子。

分布：湖北[7]。

讨论：该种主要特征为地衣体不含地衣次生代谢产物，与本研究中的新记录种P. subhimalayensis较为相似，但后者的子囊含有8 个孢子，且子囊孢子横隔型，37~45µm×4~6µm[22]。

灰色疱衣Phlyctis speireaG. Merr., Ottawa Nat.27(9): 118(1913)

地衣体壳状，子囊盘直径0.3~0.5 mm，通常具有白色粉霜，子囊椭圆形，含有单孢或2 个孢子,子囊孢子无色透明，砖壁型，40~80μm×25~35μm,I-。含有降斑点酸。

研究标本：甘肃，文县邱家坝，2 620 m，杨芳20070197、20070443、20070451 (SDNU)。

基物：树皮。

分布：甘肃[2]。

讨论：该种主要特征是子囊盘表面黑褐色, 具有白色粉霜，子囊单孢或2 个孢子，子囊孢子砖壁型，40~80μm×25~35μm，含有降斑点酸。该种与P. communisChitale & Makhija 较为相似，表面均呈灰色，具有白色粉霜，子囊盘埋生在地衣体中，但P. communis子囊含有8 个孢子，子囊孢子横隔型，18~33(~45)µm×6~9µm，含有降斑点酸和水杨嗪酸[26]。

亚亮疱衣Phlyctis subargenaR. Ma & H. Y.Wang, Mycotaxon 114: 362 (2010)

地衣体壳状。子囊盘直径0.1~0.3 mm，通常3~8(~10)聚集在一起，盘面红褐色，具有白色粉霜；子囊棒状，含有2 个孢子；子囊孢子透明，砖壁型，42~78μm×30~42μm。含有降斑点酸。

研究标本：甘肃，文县邱家坝，2 450 m，杨芳20070024、20070045、20070381 (SDNU)。

基物：树皮。

分布：甘肃[9]。

讨论：该种地衣体表面严重粉芽化，子囊含有2 个孢子，含有降斑点酸。疱衣属中含有降斑点酸的物种有6 种，分别是：P.agelaea(Ach.) Flot.、P.chilensisD. J. Galloway & Guzmán、P. speireaG.Merr.、P. uncinataStirt.、P. argena(Ach.) Flot.和P.karnatakanaS. Joshi & Upreti，他们各具明显不同特征：P.agelaea地衣体表面无粉芽；P. chilensis子囊单孢，子囊孢子砖壁型，(190~)230~270(~285)μm×55~70μm；P. speirea子囊单孢或2 个孢子，子囊孢子砖壁型，40~80μm×25~35μm；P. uncinata子囊8 个孢子，子囊孢子横隔型，50~54µm×5~7µm;P.argena子囊盘较为稀少，子囊单孢，子囊孢子100~150μm×25~50μm[2,5,10,24-25]。

中国疱衣属分种检索表

1a. 子囊孢子砖壁型 ····································································································································· 2

1b. 子囊孢子横隔型 ···································································································································· 5

2a. 地衣体含地衣次生代谢产物······················································································································ 3

2b. 地衣体未检测到地衣次生代谢产物，子囊孢子73~85μm×25~37μm ··································· 裂疱疱衣P. schizospora

3a. 地衣体表面具有丰富的粉芽······················································································································ 4

3b. 地衣体表面无粉芽 ·········································································································· 灰色疱衣P. speirea

4a.子囊含2 个孢子，子囊孢子42~78μm×30~42μm ······························································· 亚亮疱衣P. subargena

4b.子囊含单孢子，子囊孢子100~150μm×25~50μm ······································································ 亮疱衣P. argena

5a. 子囊层I+紫红色，子囊孢子100~120μm×10~15μm ······················································· 卡纳疱衣P. karnatakana

5b. 子囊层I-，子囊孢子60~73µm×12~16µm ······················································类喜马拉雅疱衣P. subhimalayensis

致谢感谢中国科学院微生物研究所菌物标本馆的邓红高级实验师在借阅标本方面提供帮助；中国科学院微生物研究所魏江春课题组的任强研究员提供样品，魏鑫丽研究员对本文提出了宝贵建议。