虎奶菇产纤维素酶条件优化的研究

黄碧芳，付剑杰，林文雄

(福建农林大学，福建 福州 350002)

目前草本生物质能源数量巨大，但工农业中草本资源的利用率很低，主要由于其自身组成复杂，特别是纤维素的结晶度、聚合度以及环绕着纤维素与半纤维素缔合的木质素鞘，木质素与半纤维素以共价键形式结合，将纤维素分子包埋在其中，导致它的难降解性。菌草是经过科学实验证明适合用于栽培食 (药)用菌的草本植物，包括芒萁、五节芒、象草等草本植物，也包括作物秸秆。食用菌能以菌草为原料，生长获得可食用菌体，可见食用菌能够有效分解并利用菌草资源。而利用微生物产生的纤维素酶降解纤维素也是当前生物质能源的研究热点之一。本实验前期已采用刚果红鉴别培养基即酶活测定，从18种食用菌中筛选出虎奶菇。本实验尝试以食 (药)用真菌虎奶菇作为出发菌株，以菌草为碳源发酵产纤维素酶，研究产酶条件，为能源草资源能开发利用提供更全面的参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试材料

虎奶菇Pleurotus tuber-regium(Fr.)Singer，Pl0001来自福建农林大学菌物研究中心。

1.1.2 培养基

斜面培养基 (PDA)[1]:活化、保藏菌种;液体培养基(GPY)[2，3];

发酵产酶培养基:菌草5 g、营养液 〔(NH4)2SO40.2%、MgSO40.05%、KH2PO40.01%、蛋白胨 0.2%、酵母粉0.2%〕，pH自然。

1.2 酶活测定方法

采用3，5－二硝基水杨酸比色定糖法 (DNS)[4，5]测定酶的活力。

1.2.1 CMC酶活的测定

酶活的定义:1 mL酶液于上述条件下，1 min内产生1 μmol葡萄糖量的酶量定义为 1 个酶活力单位 “IU”[6－9]。CMC酶活力E(U·mL－1)公式为:

式中:x为回归方程所测得的还原糖量 (mg·mL－1);n为反应体系的稀释倍数;180为葡萄糖的相对分子质量 (g·mol－1);30为酶液的反应时间 (min)。

1.2.2 滤纸酶活 (FPA)的测定

酶活的定义:1 mL酶液于上述条件下，1 min内产生1 μmol葡萄糖量的酶量定义为 1个酶活力单位 “IU”[10－13]。FPA酶活力F(U·mL－1)公式为:

式中:x为回归方程所测得的还原糖量 (mg·mL－1);n为反应体系的稀释倍数;180为葡萄糖的相对分子质量 (g·mol－1);60为酶液的反应时间 (min)。

1.3 产酶条件优化

将半试管保存菌株接入装有100 mL GPY培养液中，150 r·min－1，30℃下振荡培养3 d，作为种子液。

1.3.1 不同转速对菌株产酶的影响

以5%接种量接种至100 mL液体发酵产酶培养基内，分别以 120 r·min－1、150 r·min－1、180 r·min－1、210 r·min－1培养4 d，测酶活。

1.3.2 不同培养温度对菌株产酶的影响

同上接种，分别置于25℃、30℃、35℃、40℃的恒温摇床振荡培养4 d，测酶活。

1.3.3 不同培养时间对菌株产酶的影响

同上接种，置于摇床分别培养4 d、5 d、6 d、7 d后测定酶活。

1.3.4 不同装样量对菌株产酶的影响

250 mL三角瓶分别装入50 mL、75 mL、100 mL、125 mL发酵培养基，并置于摇床中发酵培养，测酶活。

1.3.5 不同接种量对菌株产酶的影响

100 mL发酵培养基中分别接入种子培养液1 mL、3 mL、5 mL、7 mL摇床发酵，测酶活。

1.3.6 初始pH对菌株产酶的影响

调整发酵培养基初始 pH为5.8，6.4，7.0，7.5，再接入种子液置于摇床培养，测酶活。

1.3.7 不同氮源对菌株产酶的影响

分别以酵母膏、蛋白胨、尿素、KNO3、NH4Cl和(NH4)2SO4(浓度均为0.5%)作为氮源，在优化的发酵条件下进行产酶试验，测酶活。

1.3.8 不同的常规碳源对菌株产酶的影响

分别以CMC、可溶性淀粉和蔗糖作为碳源在优化的条件下进行产酶试验，测酶活。

1.3.9 不同的菌草碳源对菌株产酶的影响

分别以象草、巨菌草、五节芒、香根草、斑茅作为优化后发酵培养基碳源，摇床培养，测酶活。

1.3.10 菌草的不同添加量对菌株产酶的影响

1.3.9中得到的最适菌草碳源，按0.5%、1.0%、2.0%、4.0%添加量作为碳源进行产酶试验，测酶活。

2 结果与分析

2.1 不同转速对菌株产酶的影响

不同转速对菌株产酶的影响见图1。

由图1数据显示，随着摇床转速的提高，虎奶菇产酶的CMC酶活有一定的提高，FPA酶活提高不大，这是液体培养基中的溶氧量增加的缘故。但转速超过150 r·min－1后，菌株产酶的CMC和FPA酶活明显下降，可能是转速过高，造成机械损伤，影响了菌丝体的生长。

菌株在生长和产酶过程中要消耗氧气，所以在产酶过程中应保持振荡来增加发酵液的溶氧浓度，而且振荡还可以让菌体与发酵液中的营养物质充分接触，使菌体获得充足的营养成分。一般而言，摇床转速的不同可能会影响到通气量、营养代谢物和产物等的流动速度，进而影响到菌株的生长和产酶效果。转速太低可能导致培养基中溶氧不足，影响菌体生长，进而影响产酶;转速太高可能机械剪切力过大，造成菌丝断裂过度，破坏菌体与营养成分的粘附，也影响产酶效果[15]。

2.2 不同培养温度对菌株产酶效果的影响

不同培养温度对菌株产酶效果的影响见图2。

如图2所示，随着温度的提高虎奶菇产酶量明显上升，在30℃时，CMC酶活和FPA酶活均达到最高，其后随温度的升高而降低，且降幅巨大，说明虎奶菇对温度很敏感。

温度是影响细胞生长和发酵产酶的重要因素之一，虎奶菇细胞生长的最适温度是28℃～32℃，与产酶最适温度吻合，有利于对发酵产酶条件的控制。当温度低于虎奶菇生长的最适温度时，使其细胞内的酶代谢处于惰性状态，进而影响虎奶菇的能量和合成代谢，使纤维素酶的分泌减少。当温度高于虎奶菇生长的最适温度时，会使其细胞内的酶代谢受到高温的抑制，同样不利于纤维素酶的分泌[15]。

2.3 不同培养时间对菌株产酶效果的影响

不同培养时间对菌株产酶效果的影响见图3。

由图3可知，纤维素酶酶活力随着培养时间的延长呈现先上升后下降的趋势。在发酵第4天时，酶活水平还相对较低，培养第5天时，菌体产酶水平大幅度提高，并且CMC酶活达到最大。在之后的培养时间里CMC酶活随培养时间的延长而降低。FPA酶活却在第7天达到所测的最大值。但FPA酶活所增加的幅度远小于CMC酶活所降低的幅度，所以综合2种酶活结果，选择第5天进行虎奶菇的酶活测定。

虎奶菇液体发酵时菌丝体收集的最佳时间是在6 d～10 d，由此可知在此之前虎奶菇的菌丝体是处于迅速生长的状态，需要大量的碳源和能源供应，这些都需要CMC的分解来提供。所以在这段时间适于测定纤维素酶产量及其酶活力。

2.4 不同装样量对菌株产酶效果的影响

不同装样量对菌株产酶效果的影响见图4。

由图4可知，培养液的装样量对虎奶菇的发酵产酶的影响不大。在一定范围内，不同的装样量会通过影响通气量、发酵过程中的营养代谢物总量和产物浓度的阻遏效应等一系列因素来造成不同的产酶效果，这是综合因素导致的结果[16]。随着培养基装量的减少，溶氧量相对提高，促进菌体生长，提高纤维素酶的产量。但装样量的减少会增大机械剪切力，造成菌丝断裂过度，破坏菌体与营养成分的粘附，影响产酶效果。同时培养基装样量的减少也会造成菌株在生长时营养元素的不足，尤其是在发酵后期。这些应该就是造成50 mL和75 mL的装样量的酶活小于100 mL装样量的原因。本实验采用的三角瓶容量是250 mL，装样量为125 mL已经达到了容量的一半，不利于摇瓶培养，并且在100 mL装样量时虎奶菇有最高的CMC酶活，所以选择100 mL作为最佳装样量。

2.5 不同接种量对菌株产酶效果的影响

不同接种量对菌株产酶效果的影响见图5。

由图5知接种量为5 mL和7 mL时酶活基本相同。因此从节约和降低污染的角度考虑，选择最佳接种量为5 mL。1 mL时，由于接种量过少会导致菌体生长繁殖过慢，产酶活性降低，进而在发酵液中纤维素酶数量较少，导致酶活力较低。

2.6 初始pH对菌株产酶效果的影响

初始pH对菌株产酶效果的影响见图6。

由图6可知，虎奶菇在培养基随着初始pH值的升高，纤维素酶活呈现上升趋势。当初始pH值达6.4左右时，纤维素酶活力最大。在研究的范围内，确定产酶最适pH为6.4左右，pH过大或过小都会影响纤维素酶的发酵。

2.7 不同氮源对菌株产酶效果的影响

不同氮源对菌株产酶效果的影响见图7。

由图7可知有机氮源对虎奶菇的产酶有较大的影响，蛋白胨和酵母膏作为氮源其酶活远高于无机氮源的硝酸钾、硝酸铵等。说明有机氮源可促进虎奶菇对纤维素酶的合成。在有机氮源中酵母膏是最适合虎奶菇生长所需，酶活最高。

2.8 不同的常规碳源对菌株产酶效果的影响

不同的常规碳源对菌株产酶效果的影响见图8。

如图8所示，虎奶菇对3种常规碳源的利用率从高到低分别是可溶性淀粉、CMC、蔗糖。说明菌株在简单碳源和复杂碳源的存在下都可以生长和产酶，不需要专门的诱导物也可以合成少量组成型的纤维素酶。

2.9 不同的菌草碳源对菌株产酶效果的影响

不同的菌草碳源对菌株产酶效果的影响见图9。

本实验选用菌草研究中心推广种植的5种菌草研究对菌株虎奶菇产酶的影响。由图9可知，其产酶能力有明显差异，对象草的利用最高，说明象草可为产酶提供必要的营养因子，诱导虎奶菇产纤维素酶，提高发酵效率;同时与常规碳源 (图8)相比象草更能够促进纤维素酶的产生。因此蔗糖等具有高度单一结晶结构的碳源产酶效果不佳，产酶能力最差，CMC－Na等半合成纤维素衍生物碳源效果次之，而天然纤维素底物做为碳源产酶能力最高。说明虎奶菇更适合用天然纤维素做碳源。

2.10 菌草的不同添加量对菌株产酶效果的影响

菌草的不同添加量对菌株产酶效果的影响见图10。

由图10可知，在前期酶活随象草添加量的增加而提高，在1%～2%时呈基本稳定状态，但随着象草添加量的继续增加，虎奶菇的纤维素酶活却呈下降趋势。说明含量在1%～2%的象草能够满足虎奶菇生长和进行酶的合成，并且象草本身所含的化学物质对虎奶菇的产酶促进作用远远大于其抑制作用。

3 讨论

本实验选用食用菌作为研究对象，由于食用菌栽培过程就以菌草为培养基，说明食用菌能够较好的利用菌草这一可再生资源，这也就限定了选菌的范围，造成了筛选出来的菌种在经过产酶条件优化后虽然拥有较高的菌草碳源的利用率但酶活力却较低的结果，因此提高酶活将是今后研究降解菌草的中心。如本实验中所用酶液为未经提纯的初酶液，后期实验可进行提纯处理，以提高酶活等。草本生物质能源数量巨大，但利用率低，我们正努力尝试，为其变废为宝提供科学依据。

[1]胡开辉.微生物学实验[M].北京:中国林业出版社，2004.

[2]Bifang Huang，Wenxiong Lin，Peter CK Cheung，et al.Differential proteomic analysis of temperature－induced autolysis in mycelium of Pleurotus tuber-regium [J].Current Microbiology，2011，62(4):1160－1167.

[3]黄碧芳，朱鸿萍，李彩斌，等.虎奶菇菌丝体自溶蛋白质制备方法比较 [J].中国食用菌，2010，29(1):52－54.

[4]李日强，辛小芸，刘继青.天然秸秆纤维素分解菌的分离选育[J].上海环境科学，2002，21(1):8－11.

[5]张宇昊，王颉，张伟，等.一种改进的纤维素分解菌鉴别培养基[J].纤维素科学与技术，2004，12(1):33－36.

[6]谢占玲，吴润.饲料纤维素酶的研究进展 [J].青海科技，2003，10(3):24－26.

[7]吕东海，周岩民，李如治.饲用纤维素酶应用研究 [J].中国饲料，2004(10):25－27.

[8]仁太明，刘昭壮.浅谈饲用纤维索酶的生产与应用 [J].饲料工业，1995，16(3):1－3.

[9]Koo H.Cellulae treatment of cotton fabries [J].T.R.J.，1994，64(2):74.

[10]胡国全，邓宇，徐恒，等.极端嗜热厌氧纤维素菌的分离、鉴定、系统发育分析及其酶学性质的研究[J].应用于环境生物学报，2004，10(2):197－201.

[11]白洪志，杨谦，王希国，等.纤维素降解菌绿色木霉C－08的筛选及酶学特性研究 [J].安徽农业科学，2007，35(17):5033－5034.

[12]郝月，杨翔华，张晶，等.秸秆纤维素分解菌的分离筛选[J].中国农学通报，2005，21(7):58－60.

[13]包衎，王晓辉，张伟琼，等.纤维素分解菌的选育及酶活测定[J].生物学杂志，2007，24(2):56－58.

[14]陈冠军，杜宗军，高培基.耐碱性真菌纤维素酶生产菌的筛选及酶学性质的初步研究[J].工业微生物，2000，30(4):23－26.

[15]周德庆.微生物学教程 (第三版)[M].北京:高等教育出版社，2011.

[16]陈守文.酶工程[M].北京:科学出版社，2008.