基质内木质纤维素酶酶活及其产物变化*

袁胜东，罗 霞，余梦瑶，魏 巍，江 南，许晓燕，郑林用

(1.四川省农业科学院，四川 成都 610066;2.四川省中医药科学院中药与细胞分子生物学实验，四川 成都 610041;3.四川省万源市科学技术局，四川 成都 636350)

猴头菌Hericium erinaceus是著名的食 (药)用真菌，素有“蘑菇之王”的美称。猴头菌需分泌木质纤维素酶类对木质纤维素进行降解，以生成还原糖类小分子物质才能被菌丝吸收利用。食用菌的酶学研究在上世纪70年代至90年代研究的较多，其中以日本科学家关于香菇的酶学研究最多，也取得了大量的成果，发现食用菌酶活的变化规律与其生长进程有着紧密的联系，还指出漆酶对子实体形成具有调控作用[2]。在食用菌营养生理方面，也发现基质内葡萄糖的变化和食用菌生长进程相关。但目前所作研究主要集中在食用菌不同生长阶段，将基质内物质视为均匀整体对其物质及酶活变化进行测定，还未查阅到关于基质内不同部位在生长不同时期的酶活及物质研究方面的报道。将基质视为均匀整体忽略了在基质内部菌丝体可能处于不同生理阶段和不同分化程度，以及基质营养状态的差异。本文针对这一不足从空间和时间两个维度全面地研究了猴头菌基质内还原糖含量和木质纤维素酶酶活变化，以了解基质内部在不同时期代谢情况。同时结合木质纤维素酶酶活和还原糖含量之间的相关性研究找出酶活变化与生长发育相关的内在联系。

1 材料和方法

1.1 供试菌种

猴头菌HE－3，由四川省中医药科学院细胞与分子生物学实验室提供。

1.2 供试培养基

1.2.1 母种活化培养基 (马铃薯综合培养基)

马铃薯200 g、葡萄糖20 g、KH2PO43 g、MgSO41.5 g、琼脂20 g，水100 mL，pH自然。

1.2.2 原种培养基

棉籽壳78%、麦麸20%、蔗糖1%、石膏1%，含水量60%。

1.2.3 栽培基质 (栽培料)基本成分

棉籽壳79%、麦麸20%、石膏1%，含水量62%。

1.3 培养方法及条件

栽培料加水混匀后堆料过夜，次日装袋 (菌袋规格14 cm×28 cm)，每袋湿重约570 g，高约为12 cm。于121℃灭菌2 h，冷却后接原种。

菌袋在28℃恒温培养箱培养，菌丝满袋后移入菇棚，菇棚温度16℃～24℃，湿度65%～80%。

1.4 取样

如图1、表1所示取样。在菌丝长至菌袋1/4、1/2、3/4、满袋、满袋后第5天、原基出现、子实体生长第4天、子实体生长第8天、采收、采收后第5天这10个时期取样，编号1～10;取样时基质从上至下分为4等分，编号Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ。空白对照为未接种前基质 (编号0)。每次取3袋，按相同部位混匀，共取35个样品，取样后－80℃保存。

表1 取样表

1.5 酶活及物质含量测定

1.5.1 粗酶液提取

精确称取2 g样品，适当研磨后装入具塞三角瓶中，加水20 mL，于30℃水浴锅中浸提2 h，4层纱布过滤，滤液定容至25 mL，8 000 r·m－1、12℃，离心10 min，上清液即为粗酶液，EP管分装，－80℃保存。

1.5.2 木质纤维素酶酶活测定

漆酶酶活测定参照饶庆隆[1]的方法，每分钟氧化1 μmol ABTS所需的酶量为1个酶活单位，样品重复测定2次，得2次平均值;羧甲基纤维素酶酶活测定参照周长青[2]的方法，每克干样30 min降解羧甲基纤维素纳生成1 mg葡萄糖为1个酶活力单位;半纤维素酶酶活测定参照李江华等[3]的方法，每克干样10 min降解木聚糖生成l mg木糖为1个酶活性单位。

1.5.3 还原糖含量测定

还原糖含量测定参照周长青[2]的方法，重复测定3次，得3次平均值。

1.5.4 pH测定

参照《土壤农化分析手册》土壤的氯化钾盐浸提液pH(潜在酸)的测定[4]，由于菌质吸水性强，用1∶1(W∶V)浸提时液体被菌质完全吸收，故本研究用50 mL KCl浸提25 g菌质。

1.5.5 数据分析

采用Spss19.0软件进行相关性分析。

2 实验结果

2.1 木质纤维素酶酶活

2.1.1 漆酶酶活

漆酶酶活变化如图2，其中“0”号样品没有检测到酶活(图上未显示)。

图2 漆酶酶活

从图2看出，不同位置基质的酶活在整个生长过程的变化趋势基本一致，即在菌丝刚长满基质时酶活较高随后活性降低到一定水平，在采收后酶活有所上升;其中部位Ⅰ的变化趋势有所不同，在原基形成时酶活急剧升高出现一个活性高峰。

2.1.2 羧甲基纤维素酶酶活

羧甲基纤维素酶酶活变化如图3，其中“0”号样品没有检测到酶活 (图上未显示)。

图3 羧甲基纤维素酶酶活

由图3可看出，不同部位基质酶活变化趋于一致，在营养生长阶段酶活较低，呈缓慢上升趋势，原基形成时形成一个活性小高峰，此后酶活略微下降，到采收时酶活达到最高，采收后酶活降低。其中部位Ⅰ的酶活在整个生长阶段都要低于其他部位。

2.1.3 半纤维素酶酶活

半纤维素酶酶活变化如图4，其中“0”号样品没有检测到酶活 (图上未显示)。

图4 半纤维素酶酶活

从图4可以看出，半纤维素酶活与羧甲基纤维素酶酶活变化规律趋于一致。

2.2 还原糖含量

还原糖含量变化如图5。

图5 还原糖含量

从图5可看出，基质内不同部位还原糖含量变化趋于一致，在菌丝刚长满时含量较高，随后含量逐渐降低，原基出现时含量达到低点，生殖生长阶段还原糖含量逐渐增加，到接近采收及采收时含量达到一定峰值，采收后含量降低。其中部位Ⅳ基质含量略高，部位Ⅲ、部位Ⅱ、部位Ⅰ基质含量逐次降低，部位Ⅰ基质在原基形成后还原糖含量升高趋势有所不同，采收时含量超过其他样品。

2.3 pH值

pH值如表2所示。

表2 PH

从表2可看出，基质长满菌丝后pH值从5.95降到4.6左右，各部位pH值相差不大且在不同时期变化不大，在生长后期pH值有所降低，采收后降到最低。

2.4 相关性分析

偏相关结果分析显示，以半纤维素酶酶活和羧甲基纤维素酶酶活为控制变量，漆酶酶活与还原糖含量呈中度相关 (r=0.420，P=0.015);以半纤维素酶酶活和漆酶酶活为控制变量，羧甲基纤维素酶酶活与还原糖含量呈中度相关 (r=0.346，P=0.049);以羧甲基纤维素酶酶活和漆酶酶活为控制变量，半纤维素酶酶活和还原糖含量无显著相关性;pH值与上述酶活无显著相关性;羧甲基纤维素酶酶活与半纤维素酶酶活呈极显著相关 (r=0.000，P=0.933)。

3 讨论

基质内不同部位的木质纤维素酶酶活和还原糖含量都有明显的差异，在菌丝生长活跃的区域 (Ⅰ－1、Ⅱ－2、Ⅲ－3、Ⅳ－4)表现出了较强的漆酶酶活和较高的还原糖含量，说明在菌丝刚生成时木质素降解反应活跃，生成了大量的还原糖以提供其营养需要。越靠近袋口的基质表现出越低的酶活和较少的还原糖含量，部位Ⅰ基质纤维素酶、半纤维素酶和还原糖含量都在相同时期基质中数值最低。这可能是由于该部位最先长满菌丝，菌丝自身老化或者该部位菌丝经过分化转为生殖生长进行着不同的代谢反应，也可能是由于基质较早被酶分解利用导致基质内营养含量减少。基质内不同部位还原糖含量在生殖生长后期变化趋势有所不同，最后呈现出上高下低的状态，这可能与基质内部糖类转移有关。

变化趋势方面，基质内不同部位木质纤维素酶酶活和还原糖含量变化趋势基本相同，在猴头生长发育的几个重要时期都有明显的变化:在菌丝刚长满基质时表现出较高的漆酶酶活和还原糖含量;几种酶的酶活都在原基形成时出现活性高峰，还原糖含量在原基形成时含量降到最低谷;羧甲基纤维素酶、半纤维素酶以及还原糖含量都在采收时出现峰值。这些都说明木质纤维素酶酶活和还原糖含量的变化与猴头菌生长发育相关。其中漆酶酶活在原基出现时变化最为强烈，峰值最高，且该变化只出现在与原基形成位置直接相关的部位Ⅰ基质，这也进一步说明漆酶与原基形成有着密切的联系。采收后漆酶、羧甲基纤维素酶、纤维素酶酶活都有变化为营养生长阶段的趋势，为下个周期的原基形成做准备。

有报导显示原基的形成与还原糖的大量消耗有关[5]，而还原糖是木质纤维素酶类所催化反应的终产物，为了了解木质纤维素酶酶活与还原糖含量的关系，对木质纤维素酶酶活与还原糖含量进行了相关性分析。相关性分析显示漆酶酶活、羧甲基纤维素酶酶活与还原糖含量呈中度相关，虽然半纤维素酶酶活与还原糖含量无显著相关性，但半纤维素酶酶活与羧甲基纤维素酶酶活呈极显著相关，半纤维素酶酶活能极大影响羧甲基纤维素酶酶活，这些说明了还原糖的生成受到了木质纤维素酶的影响，进而对猴头菌的生长发育产生影响。

温度和pH值对酶活影响较大，但本次试验猴头菌的营养生长阶段在恒温培养箱进行温度稳定，生殖生长阶段在菇棚进行，温度变化在16℃～24℃之间，变化不是很大且不可控，故本次试验结果排除了温度对酶活的影响。通过pH测定显示样品pH值在4.25～4.67之间变化，各部位pH值变化不大，相关性显示pH值未能对酶活产生影响。

基质内不同部位木质纤维素酶酶活和还原糖含量有较大的差异，排除pH和温度可能对酶活的影响，提示基质内不同部位菌丝体可能处于不同的生理阶段和分化程度，从而导致了代谢反应的差异。木质纤维素酶和还原糖与猴头菌生长发育密切相关，木质纤维素酶可能通过调节基质内还原糖含量对猴头菌生长发育产生影响，其中漆酶与猴头菌原基形成联系最为密切。

[1]饶庆隆.金针菇产漆酶发酵条件研究 [D].南京农业大学硕士学位论文，2005:15－16.

[2]周长青.白灵菇栽培基础生理和关键技术研究[D].山东农业大学博士学位论文，2007:46－50.

[3]李江华，房峻.半纤维素酶高产菌种的选育及产酶条件 [J].无锡轻工大学学报，2004，23(5):48－51.

[4]劳家柽.土壤农化分析手册 (第一版)[M].北京:中国农业出版社，1988.

[5]冯志勇.斑玉蕈对基质中葡萄糖浓度变化的响应 [R].第九届食用菌学术讨论会学术报告.