覆土中放线菌对暗褐网柄牛肝菌出菇的影响*

王文兵，曹 旸，纪开萍，刘 静，张春霞，何明霞

(云南省热带作物科学研究所，云南 景洪 666100)

暗褐网柄牛肝菌Phlebopus portentosus(Berk＆Broome)Boedijn，又名巨型牛肝菌、黑牛肝菌等，分布在中国云南、广西和海南等地[1－3]，味道鲜美、营养丰富，深受产地消费者的喜爱，实现其人工栽培具有重要的意义。Lumyong和Sanmee[4，5]报道，在培养皿中以腐生菌的培养基培养暗褐网柄牛肝菌，可产生子实体和担孢子，担孢子能够萌发，只是子实体的形态不好，且产量很低。

笔者曾设计不同覆土方法研究覆土对暗褐网柄牛肝菌子实体形成的影响，探讨其出菇与覆土的密切相关性，并通过覆土中混入细菌、放线菌的对比试验，发现覆土中的微生物对其子实体形成有一定的促进作用[6]。本文中，笔者通过覆土中放线菌的分离纯化，回接无菌覆土进行对比栽培试验，进一步研究了覆土中放线菌对暗褐网柄牛肝菌子实体生长的影响，并通过16S rDNA序列分析对有益放线菌菌株进行了初步鉴定。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 暗褐网柄牛肝菌菌株

菌株编号B－01－3－11，2003年由采自云南景洪凤凰木 (delomix regia)树下的野生子实体分离获得，保存于云南省热带作物科学研究所，其人工培养的子实体凭证标本存放于中国科学院昆明植物研究所真菌标本室，标本编号:HKAS49706号。

1.1.2 覆土

由果园土壤、草炭等体积混合，加水至含水量60%。

1.1.3 培养基质

液体培养基 (每升):去皮马铃薯200.0 g(煮沸30 min)、葡萄糖20.0 g、酵母膏1.0 g、MgSO41.0 g、KH2PO41.0 g。

子实体培养料:干橡胶木锯末10 kg、谷粒5 kg、MgSO415 g、KH2PO45 g，加水拌匀至含水量60%，pH在6左右。分装入500 mL玻璃广口瓶，每瓶鲜料400 g，121℃灭菌60 min。

1.2 方法

1.2.1 覆土中放线菌的分离

采用琼脂平板稀释分离法:覆土在室温下风干10 d后取1 g加入10 mL无菌水，制成10%的土壤悬液。然后梯度稀释使其终浓度达到10－6。取上述土壤悬液滴于加50 mg·L－1重铬酸钾抑制剂的改良高氏1号琼脂培养基平板，均匀涂布，每个浓度3次重复。28℃培养7 d～15 d后挑取单菌落，转接于改良高氏1号琼脂斜面。28℃培养，待菌落长满斜面后移至4℃冰箱保存。

1.2.2 放线菌回接覆土栽培试验

暗褐网柄牛肝菌液体菌种、固体菌种及放线菌菌悬液的制备方法参照曹旸等[6]的方法。

待牛肝菌菌丝长满广口瓶中的固体培养基质后，进行覆土出菇试验。覆灭菌土 (121℃，60 min)，并在无菌条件下分别添加各放线菌菌悬液，混匀，使覆土中放线菌浓度约为100 cfu·g－1，之后封口培养至覆土层长满菌丝，再敞口培养[6]，以覆灭菌土为对照，覆土厚度4.0 cm，每处理7个重复。

将上述覆土后的栽培瓶移至砖混泡沫板菇房中，保持温度28℃～30℃、光照100 lx～300 lx、湿度90%～95%培养。记录牛肝菌菌丝在覆土层的生长情况、原基发生及子实体生长情况，并以Duncar新复极差法 (DPS7.0)对数据进行分析。

1.2.3 有益放线菌菌株16S rDNA序列分析

以SK1201－UNIQ－10柱式细菌基因组 DNA抽提试剂盒，生工生物工程 (上海)公司，提取有益放线菌基因组DNA。以PCR引物 Primer 27F(5′－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3′)和 Primer 1492R(5′－GGTTACCTTGTTACGACTT －3′)进行PCR扩增，PCR反应体系:模板10 pmol;Primer 27F(10 μmol·L－1)1 μL;Primer 1492R(10 μmol·L－1)1 μL;dNTP mixture(10 Mm each)1 μL;10 × Taq Reaction Buffer 5 μL;Taq(5 U·μL－1)0.25 μL;加水至 50 μL。PCR 反应条件:预变性98℃、5 min;循环95℃、35 s，55℃、35 s，72℃、1 min、30 s，35个循环;延伸8 min。

扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后割胶纯化，并进行测序。根据测序结果，在GenBank中进行同源序列搜索，并调出相关的16S rDNA序列用Clustal X[7，8]软件进行多序列比对，通过 MEGA3.1 软件[9，10]选用 Kimura 2－parameter距离模型计算进化距离，用Neighbor－Joining法构建系统发育树，1 000次随机抽样计算Bootstrap值以评估系统发育树的置信度。

2 结果与分析

2.1 放线菌菌株对暗褐网柄牛肝菌出菇情况的影响

覆土中共分离纯化得到37株放线菌菌株。通过回接覆土试验检测它们对暗褐网柄牛肝菌出菇情况的影响，见表1。

表1 放线菌菌株对暗褐网柄牛肝菌出菇情况的影响

续表

从表1中可以看出，覆土中加入放线菌菌株C20、T20、C6、36、34、T30、14的处理，牛肝菌菌丝长满覆土层的时间比对照 (CK)提前3 d以上，达极显著水平，说明这7个菌株能够促进牛肝菌菌丝生长。

覆土中加入放线菌菌株T5、菌株9的处理，原基发生时间比CK提前10 d以上，达极显著水平。在原基数目上，添加放线菌菌株9、菌株21的处理与对照相比达到极显著差异水平。说明这四株放线菌能促进原基发生。

在子实体成熟数上，14个添加放线菌的处理在数值上高于CK，但所有处理与两对照相比都没有达到显著差异水平。

在平均单菇重量上，添加放线菌菌株17、菌株T21的处理与对照相比达到显著差异水平，是对照的3倍以上，说明菌株这两株放线菌能够促进子实体生长。

2.2 有益放线菌菌株16S rDNA序列分析

上述试验中，对暗褐网柄牛肝菌出菇有促进作用的共有12株放线菌菌株，它们的16S rDNA测序结果经修正后已向GeneBank提交序列 (登录号:JN248568～JN248579)。根据16S rDNA序列同源性，构建了包括这12株放线菌在内的系统发育树，结果见图1。

从16S rDNA序列聚类分析结果可以看出，12株放线菌中11株属于链霉菌属，1株属于游动放线菌属。

图1 基于16S rDNA序列构建的系统发育树

3 讨论

由覆土中共分离纯化得到37株放线菌菌株，通过回接覆土试验检测它们对暗褐网柄牛肝菌出菇情况的影响。其中有12个菌株分别在牛肝菌菌丝生长、原基发生及子实体生长等方面表现出促进作用。

16S rDNA序列分析结果显示，12株放线菌中11株可归为链霉菌属 (Streptomyces)，1株归为游动放线菌属 (Actinoplanes)，将它们鉴定到种还需要进行进一步的生理生化试验。

笔者曾报道在暗褐网柄牛肝菌人工栽培中，覆土及覆土中微生物的重要性[6]。本文结果表明，在覆土所包含的众多微生物中，放线菌的几个类群可能对暗褐网柄牛肝菌子实体的形成和生长有促进作用，但它们的作用机理还有待进一步的研究。

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