芥菜籽提取物对人结肠癌细胞系SW480凋亡的影响

朱明古，郭 文*，袁海锋

(1南方医科大学南方医院、广东省胃肠疾病重点实验室，广州 510515;2菏泽市立医院)

目前，对于晚期转移或不可切除结肠癌患者的化疗以及术后辅助性化疗仍以 5-FU为主，但其总有效率仍不尽人意。近年来有研究发现，芥菜籽及其活性提取物具有抗癌防癌活性[1～3]。因此，我们用芥菜籽提取物(MSE)直接作用于体外培养的人结肠癌细胞 SW480，以探讨其对 SW480细胞体外增殖及凋亡的机制。

1 材料与方法

1.1 材料 人大肠癌 SW480细胞株由本实验室传代培养。芥菜籽购自湖北圣峰药业有限公司。二甲亚砜 (DMSO)、RPMI1640和青、链霉素 (青霉素1 000 U/ml，链霉素 1 000 U/ml)、细胞计数测定试剂盒(CCK-8 kit)及 Caspase-3检测试剂盒均为碧云天公司产品，胎牛血清(FBS)为杭州四季青产品;Hoechest33258染色试剂盒购自南京凯基生物公司。AnnexinV-PE/7AAD细胞凋亡测定试剂盒购自 Millipore公司。

1.2 方法

1.2.1 MSE的配制 10 mg/ml的 MSE贮存液以DMSO溶解配制而成，过 0.22μm微孔滤膜，置 4℃保存。用前恢复室温，以 10%FBSRPMI1640培养液稀释成相应浓度的工作液[4]。

1.2.2 细胞培养和处理 人结肠癌 SW480细胞以含 10%FBS、100 U/ml青霉素、5%CO2的湿润培养箱中培养。以含不同浓度 MSE的 10%FBS RP-MI1640链霉素为培养液(pH 7.4)，置 37℃培养不同时间后进行实验分析。

1.2.3 细胞生长抑制实验 取生长良好的人结肠癌 SW480细胞，配成单细胞悬液，稀释成 100×106/L;加至 96孔板 ，每孔 100 μl，在 37 ℃、5%CO2培养箱内培养 24 h，弃去原培养液，加入不同浓度 MSE的 10%FBS RPMI1640培养液，设置成 0.2、0.4、0.8、1.0 mg/ml共 4组，同时设置只加培养基的空白孔，每个药物组和空白组都设 5个复孔，继续培养;作用 24、36、48和 72 h后于实验各孔分别加CCK-8试剂 10μl，37℃继续孵育 4 h，酶联免疫检测仪测定各孔的吸光度值(测定波长 450 nm，参比波长 650 nm)。以时间为横坐标，细胞 OD值为纵坐标绘制细胞生长抑制曲线;以时间为横坐标，细胞增殖抑制百分率(%)=(1-实验细胞 OD值/对照细胞 OD值)×100%为纵坐标绘制 MSE对 SW480细胞增殖的抑制率曲线。

1.2.4 细胞凋亡的形态学特征观察 在人结肠癌SW480细胞中加入含不同浓度 MSE的 10%FBS RPMI1640培养液 ，设置成 0.2、0.4、0.8、1.0 mg/ml，以不含 MSE的 10%FBSRPMI1640培养液为对照组，培养 12、24、48 h后于倒置显微镜下观察。2.5 ml培养液(含细胞 4×106/ml)培养于 6孔板，不加药组为对照;于加药 12、24、48 h后 ，用 PBS洗涤 2次，Hoechest33258染色，荧光显微镜下观察细胞形态学改变和凋亡小体的形成。

1.2.5 流式细胞仪检测细胞凋亡 实验分组及细胞处理同前，培养 24 h后，收集 SW480细胞，用预冷的 PBS缓冲液洗细胞 2次;再用 1×Binding Buffe制成 1×106/ml的悬液，加入 AnnexinV-PE与核酸染料 7AAD，轻轻混匀，室温避光处放置 15 min，加入 400μl 1×Binding Buffer，流式细胞仪测定结果。

1.2.6 MSE对 SW480细胞 Caspase-3活性的影响将 SW480细胞消化、吹匀后分别转入 75 cm2培养皿中，每瓶细胞数相等，约 1×107，培养液量 5 ml。按预设终浓度加入 MSE，37℃、5%CO2孵箱中孵育 24 h。2.5 g/L胰酶消化细胞，收集入 15 ml离心管中，4℃离心。细胞置于冰浴中，冷 PBS液洗 2遍，离心，弃上清。每管加入 Cell lysis buffer，调整细胞浓度为1×1010/L。反复冻融以裂解细胞(置于液氮中迅速冷冻，室温下融化)，于冰中孵育 15 min。14 000 r/min，4℃离 20 min，收集上清液于 Ep管中。用 Bradford法测定蛋白浓度，按说明书设置反应体系，37℃孵 2 h，酶标仪测定 A405，根据测得的吸光度值计算单位质量蛋白中所含 Caspase-3的酶活力。

1.3 统计学方法 采用 SPSS13.0统计软件，结果以±s表示，所测数据进行单因素方差分析。P≤0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MSE对 SW480细胞生长的抑制作用 不同浓度的 MSE作用于 SW480细胞 24、48、72 h，0.2 mg/ml以上浓度的 MSE对细胞的生长有明显的抑制作用，0.2～1.0 mg/ml表现为时间和浓度的依赖性。随药物作用时间延长和浓度增加，细胞生长抑制率逐渐升高，MSE作用 72 h生长抑制最明显。1.0 mg/ml的 MSE作用 72 h的细胞生长抑制率明显高于其他浓度药物的抑制率(P均 ＜0.01)，最高可达60%以上。见图1。

图1 MSE对 SW 480细胞的生长抑制作用

2.2 细胞凋亡的形态学特征 用 0.2 mg/ml MSE作用 24 h后，即可出现凋亡细胞形态学改变，主要表现为胞核浓缩及核碎裂等改变，而未加 MSE组的细胞质、胞核均呈均一的蓝色。

2.3 MSE对 SW480细胞凋亡的影响 不同浓度的MSE(0.2～1.0 mg/ml)作用 SW480细胞 24 h后 ，细胞早期凋亡率分别为(16.39±1.84)%、(19.92±1.85)%、(11.92±2.41)%和(11.08±2.52)%;细胞晚期凋亡率分别为(4.02±0.67)%、(4.24±0.42)%、(14.34±3.19)%和(20.88±4.07)%。空白对照组 24 h后细胞早期和晚期凋亡率分别为(3.32±0.75)%和(0.96±0.45)%。表明随着药物浓度的增加，SW480细胞凋亡率逐渐增加，且细胞逐渐从早期凋亡走向晚期凋亡，与其增殖抑制作用一样，也呈浓度—效应依赖性。

2.4 MSE对 Caspase-3蛋白酶活性的影响 空白对照组与不同浓度的 MSE(0.2～1.0 mg/ml)作用SW480细胞 24 h后，Caspase-3蛋白酶活性分别为(11.31±0.79)、(22.76±8.27)、(26.62±8.08)、(34.11±4.47)、(36.69±2.96)U/mg。不同浓度MSE作用组与空白对照组比较均有统计学差异(P均 ＜0.05)，并呈浓度依赖性。

3 讨论

现代医学研究证实，芥菜籽中的异硫氰酸酯、谷甾醇等成分均有较好的抗癌活性[5]。我们研究发现，MSE体外对人结肠腺癌细胞株 SW480细胞有抑制生长作用，抑制率随药物浓度的增加而增加，具有剂量依赖关系;随着作用时间的延长而增加，具有时间依赖关系。用 Hoechest33258染色后在荧光显微镜下观察到 MSE组出现大量的胞核浓缩、核碎裂及染色体边集浓染的凋亡细胞。AnnexinV-PE/7AAD双染流式细胞仪检测，发现细胞凋亡率随 MSE浓度的增加而逐渐增加，且细胞逐渐从早期凋亡走向晚期凋亡，呈浓度—效应依赖性。表明 MSE对 SW480细胞的生长抑制作用可能是通过凋亡诱导途径来实现。

细胞凋亡途径主要有 2条，一条是通过细胞膜上的死亡受体激活 Caspase，另一条是通过胞质内的线粒体途径释放细胞凋亡因子激活 Caspase，而内质网的凋亡信号途径往往归并于线粒体途径。虽然诱发凋亡的信号及其途径千差万别，但是凋亡执行者Caspase却是相同的，Caspase系列下游分子Caspase-8、Caspase-9、Caspase-12分别在死亡受体途径、线粒体途径及内质网途径中担当着分子开关的角色[6]。而 Caspase-3作为凋亡效应蛋白是细胞凋亡 3条途径的共同下游通路，是 Caspase酶联反应的终末因子[7]。正常情况下 Caspases以无活性的酶原形式存在，在凋亡诱导信号作用下，通过蛋白水解去除氨基端的一段序列而被激活，激活的Caspase-3裂解细胞的关键结构蛋白和看家蛋白。因此，Caspase-3目前认为是在 Caspase家族中多种诱导剂刺激后导致凋亡的关键酶。为了进一步证明MSE对细胞的凋亡诱导作用和推测其凋亡作用的机制，我们对 Caspase-3蛋白酶的活力进行了测定。结果显示在 24 h内 MSE作用于 SW480细胞组较对照组 Caspase-3活性明显增强。由此可见，Caspase-3参与 MSE诱导的 SW480细胞凋亡。

肿瘤的发生、发展不仅与肿瘤细胞分化异常、细胞增殖过度有关，而且与细胞凋亡减少有关[8]。目前临床上应用很多的抗肿瘤药如 5-FU、顺铂、丝裂霉素等被发现均可诱导肿瘤细胞凋亡，诱导凋亡是其抗肿瘤的重要机制之一。本研究表明这也是MSE抗结肠癌的一个作用机制。MSE多种活性成分到底是何成分中有诱导凋亡作用尚不清楚，有待进一步研究。

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